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Gene expression, come misurarla

7 giugno 2011 in lente di barlow by Manuel | No comments

Generalmente un gene può essere in due stati, mutualmente esclusivi: acceso o spento. Quando un gene è acceso, si dice che è espresso, e questo significa che si trova in condizioni tali per cui il complesso sistema della RNA polimerasi II e dei fattori di trascrizione è in grado di leggere la sequenza del gene e sintetizzare una molecola di RNA messaggero complementare. Questo RNA messaggero viene chiamato anche trascritto. Un gene può essere espresso solo se la sua sequenza è fisicamente accessibile alle proteine trascrizionali. Se invece questa sequenza è condensata il gene non può essere espresso perché il complesso trascrizionale non può accedervi. Immaginate di avere un filo di lana, questo filo può essere disteso o condensato, convoluto su sé stesso a formare un gomitolo. Nel primo caso è accessibile nel secondo è inaccessibile. L’essere accessibile o no dipende da una serie di fattori che vengono studiati col termine di epigenetica. Dei circa 25000 geni che quasi ogni cellula umana possiede soltanto alcuni saranno “accesi”, mentre i restanti saranno silenziati. Il particolare pattern di espressione genica conferisce alle cellule fenotipi differenti. Quindi, cellule diverse (ad es epatociti, neuroni, macrofagi) pur avendo un genoma identico all’interno del loro nucleo, si comportano in maniera estremamente diversa perchè esprimono geni differenti. E’ però possibile identifcare dei geni che sono costantemente espressi in tutte le cellule; questi geni vengono detti Geni housekeeping, e sono generalmente geni coinvolti nelle funzioni basali di cui ogni cellula necessita. Inoltre, l’espressione genica non è costante nel tempo, ma varia al variare delle condizioni. Se si studia l’espressione genica di un tessuto ad esempio in condizioni di normossia prima e ipossia dopo, possiamo apprezzare una variazione dell’espressione di numerosi geni.
Ci sono diversi parametri che possiamo valutare per studiare l’espressione genica, in particolare possiamo misurare il cosiddetto trascrittoma, ovvero l’insieme dei trascritti che una cellula presenta in un determinato momento; oppure possiamo misurare le proteine.
Trovare il messaggero di un gene è la prima evidenza che il gene è espresso, per le ragioni che ho detto prima, anche se bisogna tenere conto di diversi fattori, come l’emivita del messaggero e il tasso di sintesi proteica. Per trovare e identificare i messaggeri (associarli cioè al gene da cui derivano) abbiamo due vie. La prima consiste nell’utilizzo della PCR quantitativa. Questa tecnica deriva dalla PCR normale che consiste nell’amplificare una determinata sequenza di DNA o RNA utilizzando due sequenze specifiche che si appaiano con le due regioni terminali della sequenza di interesse (a 5 primo e a 3 primo) o per le due regioni fiancheggianti (a destra e a sinistra) se la sequenza di interesse fa parte di una più lunga. Queste sequenze utilizzate sono chiamate primers e sono disegnate in modo che la DNA polimerasi sia in grado di amplificare esponenzialmente la sequenza compresa tra loro. La PCR è una tecnica che si basa su cicli di amplificazione. In ogni ciclo il numero di copie di una sequenza approssimativamente raddoppia (questo è vero solo per un determinato periodo, dopo l’amplificazione cessa di essere esponenziale); Attraverso l’utilizzo di sonde fluorescenti che aumentano il loro segnale all’aumentare del numero delle copie della sequenza di interesse noi possiamo rilevare attraverso dei sensori in tempo reale il ciclo al quale questo segnale fluorescente supera una determinata soglia che sarà calcolata in base al rumore di fondo della reazione, e grazie ad un sistema di calibrazione o taratura siamo in grado di risalire alla quantità di sequenza (DNA o RNA) iniziale. Una sequenza più abbondante determinerà un segnale positivo ad un ciclo di amplificazione minore, e viceversa. E’ una versione estremamente semplificata di un discorso più complesso, ma l’importante è il concetto: con una PCR quantitativa (o real time) siamo in grado di quantificare il numero di copie della sequenza (per la quale abbiamo disegnato i primer) in un determinato campione. Per come è stata disegnata, la Real Time PCR è una tecnica utile per quantificare in modo assoluto (in termini di concentrazione) un numero limitato di sequenze per volta. Per cui con questa tecnica riusciamo a quantificare un numero limitato di messaggeri per esperimento.
Però sempre più spesso noi vogliamo conoscere la situazione globale, analizzando l’espressione di centinaia/migliaia di geni contemporaneamente. Quello quindi che vogliamo ottenere è un Gene Expression Profile, per gli amici GEP. Ricorrere alla PCR quantitativa per fare un GEP è impensabile. Tradizionalmente per questi scopi vengono usati i cosiddetti Microarray.
Introduciamo il concetto di Microarray. Un Microarray è una piattaforma di vetro o simili, delle dimensioni di un vetrino da microscopio (chiamato arraychip). Su questa piattaforma sono caricate delle sequenze di DNA (se parliamo di DNA microarray), disposte in un ordine ben preciso a formare una matrice, di file e colonne.

Come ci finiscono delle sequenze su un vetrino? Il processo di Loading è ormai robotizzato, ed esistono due diversi metodi: gli spotted microarray in cui vengono caricate ordinatamente delle microgocce (spot) ciascuna con una concentrazione picomolare di una sequenza complementare e specifica ad un unico RNA messaggero. Ci sono anche gli in situ synthetised arrays, in cui le sequenze sono direttamente sintetizzate in situ, sul vetrino stesso. Quello che è importante capire è che in un modo o nell’altro avremo una griglia ordinata di cluster di sequenze e ciascuno di questi cluster è specifico per un unico trascritto.
Moltissime aziende biotecnologiche hanno messo sul mercato arraychip sempre più moderni e all’avanguardia e a prezzi sempre più competitivi (L’affymetrix, l’Illumina, l’Agilent technologies ecc..).
Ci sono Chips in grado di misurare l’espressione di 28000 geni per campione. Inoltre, l’affidabilità dei risultati è garantita dal fatto che ci sono più tipi di sonde per ciascun trascritto, per garantire specificità e riproducibilità dei risultati.

due ArrayChip dell'Affymetrix notate le dimensioni in confronto al fiammifero

Ok, perfetto. Io ho questi chip, che possono comodamente stare in una mano, su questi chip sono caricati con un ordine ben preciso le sonde (sequenze) specifiche per un trascritto. Ma come faccio a misurare effettivamente l’espressione genica con questi chip? In parole povere,molto povere, si fa quanto segue:
1) Prima di tutto si disegna l’esperimento. Poniamo di volere analizzare l’espressione genica di cellule tumorali prelevate da una biopsia e confrontarla con il tessuto di origine. Questo tipo di esperimento ha lo scopo di esaminare quali sono quei geni che hanno un livello di espressione diverso nelle cellule tumorali rispetto al tessuto normale. E soprattutto, un esperimento di questo tipo permette di avere una visione d’insieme di tutti i geni espressi in un dato momento.
2) Si determinano i campioni da utilizzare, la ripetibilità, i controlli positivi e negativi e i costi dell’esperimento.
3) Si ordinano i chip scelti in modo che possano dare le risposte al tipo di esperimento disegnato
4) Si preparano i campioni, in questo caso un certo numero di biopsie tumorali e un certo numero di tessuti di controllo, dai quali si estrae l’RNA messaggero totale. Una volta estratto, l’RNA deve essere testato per la sua qualità. Visto che l’RNA ha una natura instabile tende a degradarsi. Per cui assicurarsi che i campioni non siano degradati è fondamentale.
5) Il passo successivo è la retrotrascrizione, Poiché come ho detto l’RNA è instabile, i messaggeri si retro trascrivono in DNA grazie alla Trascrittasi Inversa. Il problema è che dobbiamo trascrivere tutti i messaggeri presenti, per cui non possiamo usare primers specifici per ogni trascritto per ovvie ragioni. Si sfrutta pertanto la coda di poliA che viene aggiunta dopo la sintesi dell’RNA da una poliA polimerasi cellulare. Utilizzando un primer di poliT si retrotrascrive il filamento di DNA complementare. Quindi si ottiene un ibrido DNA/RNA. l’RNA viene digerito da una RNAasi, e si ottiene un singolo filamento di DNA. A questo punto, per sintetizzare il filamento di DNA complementare, o si usano i cosiddetti random primers, ovvero oligonucleotidi che per ragioni probabilistiche si appaieranno casualmente e quindi potranno dare inizio alla sintesi del filamento, oppure si sfrutta il fatto che il single strand DNA assume delle conformazioni particolari perchè è altamente idrofobico e quindi si ripiega su se stesso stabilizzandosi; in questo modo si sfrutta questo ripiegamento come se fosse un primer e si sintetizza il secondo filamento. Un passaggio fondamentale è quello di marcare, durante la retro-trascrizione, le sequenze di DNA con dei marcatori fluorescenti; in particolare si marcano le sequenze dei campioni tumorali con un fluoroforo (ad esempio la Cianina 5, Cy5 che a dispetto del nome ha un picco di emissione nel rosso, 670nm) e le sequenze retrotrascritte dai campioni di cellule sane con un fluoroforo diverso (ad es la Cy3 che ha un picco di emissione nel verde 570nm). La marcatura delle sequenze può essere diretta o enzimatica.
6)A questo punto, per ogni chip di microarray si mescolano un campione tumorale ed uno normale (ricordo che sono marcati in modo diverso) e si depositano micro-aliquote di questo mix per ogni spot sul vetrino di microarray (è tutto robotizzato). In questo modo le sequenze di DNA marcate dei campioni da analizzare si ibridano in modo proporzionale alla loro concentrazione alle sonde specifiche fissate sul microarray. In questo modo solo le sequenze che in modo specificano si legano alle sonde rimangono, quelle che invece non sono specifiche vengono successivamente “lavate via”. Questo avviene in ogni spot del microarray, laddove una sequenza marcata trovi una sua sequenza complementare e specifica.
7)La piastra di microarray, dopo che è avvenuta l’ibridazione, viene letta ad uno scanner con due laser (ad esempio un laser ad Argon e uno all’Elio/Neon che eccitano i fluorofori a particolari lunghezze d’onda, e questi in risposta emettono fotoni che vengono rilevati da un sensore. Viene quindi rilevata la fluorescenza delle sequenze marcate ibridate alle sonde. Gli spot in cui soltanto le sequenze tumorali si sono ibridate alle sonde fissate daranno un segnale rosso. Questo vuol dire che il gene del messaggero in questione era espresso solo nelle cellule tumorali e non nelle cellule normali. Se lo spot invece dà un segnale verde, allora vuol dire che quel messaggero era espresso solo nelle cellule normali. Se lo spot non dà nessun segnale, ovviamente il gene non era espresso in nessuno dei due campioni, ma i casi più frequenti sono le situazioni intermedie in cui abbiamo entrambi i segnali, stabilire l’intensità di questi segnali permette di capire quale dei due è più forte. Poiché la misurazione è influenzata anche dalla quantità di marcatori fluorescenti incorporata nelle sequenze da ibridare, è opportuno quantificare questo parametro.
Ovviamente tutti questi segnali vengono letti ed analizzati da software specifici e quello che noi otteniamo è una visione di insieme delle differenze di espressione genica di due campioni.

Ecco come appare un ArrayChip all'analisi fluorescente. Ciascun puntino corrisponde ad un Gene

Quello che otteniamo quindi non è il valore assoluto, ma la quantità relativa dei messaggeri. Con la PCR quantitativa noi avevamo una quantificazione assoluta del messaggero, qui abbiamo una quantificazione relativa. Con una PCR quantitativa posso quantificare i messaggeri di poche decine di geni, con un microarray di ultima generazione posso quantificare relativamente l’espressione di tutti o quasi i geni di un organismo. In molti casi, per validare i risultati ottenuti con i microarray viene eseguita la PCR quantitativa sui geni che si ritengono essere più importanti. Con l’idea che se vedo la stessa cosa con due metodiche diverse, allora probabilmente sto vedendo una fenomeno reale.
Con i Microarray bisogna fare molta attenzione, innanzitutto si assume che l’efficienza di ogni passaggio del protocollo (dall’estrazione all’ibridazione) sia identica per ogni trascritto, e questo non possiamo dimostrarlo. Ripetere l’esperimento aiuta a eliminare gli errori casuali, ma non quelli sistematici, se ad esempio la retrotrascrizione di un messaggero non è efficiente, questo non si può modificare. Inoltre assumiamo che la quantità di messaggero sia direttamente proporzionale alla quantità di proteina, e questo non è sempre vero. Inoltre se anche vedessimo che un determinato gene è espresso dieci volte in più nel tumore rispetto al tessuto normale, non sarebbe comunque una prova definitiva che quel gene è implicato nella tumori genesi.
Contraddico ora ciò che ho detto poco fa. Il semplice rapporto tra l’intensità dei marcatori fluorescenti non è utilizzabile come misura della differenza di espressione di un gene in due campioni. Esiste un rumore di fondo, un background, che inizialmente era aggirato con l’utilizzo di cut-off. per cui, ad esempio, un gene si considerava differenzialmente espresso se il rapporto superava il 2 o scendeva sotto lo 0.5, ma questi sono cut off arbitrari e possono falsare i risultati. Molto spesso, si eseguono dei replicati, ovvero sullo stesso microarray un gene è rappresentato da più spot, sparsi casualmente sulla piastra, in modo da lavorare su delle medie e non su singoli valori. Ovviamente poi bisognerà eseguire dei test di ipotesi. L’analisi statistica dei risultati di un esperimento di Microarray e tutto tranne che banale. A seconda dei test che si usano possono venire risultati diversi. Quindi è molto difficile standardizzare e confrontare esperimenti eseguiti in laboratori diversi.
Resta comunque il fatto che i Microarray hanno dato un contributo fondamentale allo studio dell’espressione genica e hanno permesso di fare grandi passi avanti. I Microarray sono utilizzati per moltissime applicazioni, non solo per l’espressione genica. Ad esempio esistono gli SNPs Microarray, che servono per sondare la variabilità genetica interindividuale, e magari associare questa variabilità alle diverse risposte ai farmaci (Vedere l’articolo Non siamo tutti uguali. Questo articolo, sebbene smisuratamente lungo, è comunque una semplificazione notevole dell’argomento. la mia intenzione era queslla di illustrare nei principi generali la tecnica senza scendere troppo nei dettagli. Ecco comunque alcuni Link Utili, che rappresentano anche i siti da cui ho preso alcune delle informazioni per scrivere questo articolo

Una pagina curata dall’Università dello Utah

Link a cura della massima autoirità della bioinformatica, l’NCBI

Link sull’analisi dei dati di un esperimento di Array

Se avete domande o dubbi o se notate errori fatemelo notare senza problemi nei commenti. Provvederò a correggermi immediatamente. Grazie della pazienza, alla prossima.

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Le dimensioni contano, ma la scala di più!

12 aprile 2011 in lente di barlow by Alice | 2 comments

Questo post è inserito nel contesto de Il Carnevale della Biodiversità che è ormai giunto alla terza edizione, con il grande entusiasmo dei blogger che vi partecipano.  L’argomento di questa terza edizione è Le dimensioni contano e la nostra interpretazione ha rappresentato cercare dove le dimensioni non contano, ovvero cosa rimane costante nella varietà della vita. Gli altri blog partecipanti hanno fornito altri contributi molto molto interessanti i cui riferimenti possono essere trovati qui.

Physicists tend to look for universals and invariants whereas biologists often get preoccupied with all the variantsions in nature.

-  Jim Brown,  biologo dell’Università nel Nuovo Messico

Solo con la parola meraviglia si può descrivere ciò che si prova di fronte alla varietà delle forme di vita che conosciamo, alle sue mille sfaccettature, alle forme e alle dimensioni che spaziano dai ricci di mare, alle sequoie, agli insetti e alle diatomee. Ulteriore meraviglia deriva dalla scoperta che tutti questi organismi così diversi hanno relazioni molto più strette di quanto un primo impatto possa suggerire.

In particolare, in questo post tratteremo il risultato di una collaborazione per certi aspetti curiosa tra due biologi , Jim Brown e Brian Enquist, ed un fisico, Geoffrey West, i quali alla fine degli anni ’90 hanno cercato di spiegare come diverse  caratteristiche degli organismi viventi come il numero di battiti cardiaci, le dimensioni del cervello e dei muscoli, etc  cambino al variare delle dimensioni degli organismi stessi.

Il risultato, per certi aspetti tutt’ora controverso, è una delle poche leggi della biologia, che di fronte alla complessità e alla varietà degli organismi studiati,  suggerisce una sorta di regola generale e piuttosto semplice.  Il modo migliore per arrivare a questo tipo di leggi di scala consiste nel concentrarsi su qualche esempio.

Tutti sappiamo che tendenzialmente gli animali più grandi sono dotati di un cervello di dimensioni maggiori. E’ interessante però anche chiedersi come cambino le masse medie del cervello per animali di diversa massa e vedere se esiste qualche proporzione. Il risultato di quest’analisi è il grafico riportato.

In questo grafico a dispersione con assi logaritmici sono riportate in ascissa le masse degli animali rappresentati e in ordinata quelle dei loro cervelli

Per comodità in questo tipo di studi si utilizzano quasi sempre grafici in scala logaritmica per diversi motivi. Anzitutto occorre osservare che se mantenessimo una scala lineare il grafico non sarebbe così immediato da capire perchè i punti sarebbero molto più dispersi. Inoltre siccome ad ogni “tacca” corrisponde una moltiplicazione per 10 la scala logaritmica risulta funzionale per fare confronti tra diversi animali. Infine, se utilizzassimo la scala lineare il risultato sarebbe una curva che è tendenzialmente di più difficile interpretazione. In questi esempi utilizzando la scala logaritmica otteniamo quasi sempre dei dati che possono essere interpolati con una retta i cui parametri sono molto più semplici da studiare.  Anzi, in realtà il parametro da studiare è soltanto uno: il coefficiente angolare della retta in questione. I casi che possiamo ipotizzare sono diversi:

1) possiamo pensare che la pendenza della retta sia 1. Ciò significa che se le dimensioni (in questo caso la massa) dell’organismo raddoppiano anche le dimensioni del cervello raddoppieranno.

2) in alternativa potremmo pensare che il rapporto sia di 2/3. Il motivo è sottile. Il ragionamento è di natura dimensionale: qualsiasi sia la forma dell’organismo in questione facendo variare le sue dimensioni, la sua massa, proporzionale al suo volume varierà con la terza potenza. Le dimensioni del cervello invece si potrebbe pensare che siano proporzionali alla superficie dell’organismo in questione (perchè con l’aumentare della superficie aumentano ad esempio le cellule sensibili all’interazione con l’esterno, ovvero quelle che inviano segnali da elaborare al cervello). Per tale motivo si potrebbe pensare che, aumentando con la terza potenza delle dimensioni la massa dell’organismo e con la seconda quella del cervello il coefficiente angolare della retta sia 2/3.

Questo tipo di ragionamento può essere fatto non solo per le dimensioni di qualsiasi organo, ma anche per altre grandezze, come il numero di battiti cardiaci, la durata della vita, etc… Ciò che è interessante è che per la stragrande maggior parte di questi esempi, cervello compreso, il legame con la pendenza è sempre lo stesso. Nel nostro esempio la pendenza non si rivela infatti essere 1 e nemmeno 2/3 , bensì un numero compreso tra i due pari a 3/4.

Questo numero compare anche in altri tipi di studio, in particolare è oggett della cosiddetta legge di Kleiber che mette in relazione la massa di un organismo con l’inverso del suo rate metabolico (utilizzando come sempre la scala logaritmica). Ovviamente questo tipo di legge contiene al suo interno piccole variazioni, ad esempio tra organismi a sangue caldo, organismi a sangue freddo e unicellulari, ma pur con queste piccole differenze si applica a tutti gli animali e ai batteri (e con opportune modifiche anche ai vegetali).

In questo grafico si può vedere, in scala logaritmica, la relazione tra dimensioni di un organismo e il suo tasso metabolico.

Il motivo per cui la pendenza di queste rette è di 3/4 è rimasto piuttosto oscuro fino agli studi di West, Brown ed Enquist, che hanno derivato matematicamente questo risultato.  Il loro studio prende in esame il problema fondamentale  di ogni organismo, ovvero il rifornimento di ossigeno e nutrienti. Diversi organismi lo affrontano in modo differente: un organismo unicellulare (o semplicemente molto piccolo)  non ha grosse difficoltà perchè la maggior parte delle sue cellule è a “contatto con l’esterno” e ciò è legato a un rapporto molto alto tra superficie e volume.  Per un organismo più grande il problema del trasporto è più pressante perchè la maggior parte delle cellule che necessitano di nutrimento e ossigeno si trovano lontano dalle superfici in cui avviene lo scambio.  I risultati dopo millenni di evoluzioni sono diversi:  da dei veri e propri tubi utilizzati dagli insetti al nostro sistema circolatorio, passando per le branchie dei pesci.

Il fatto che il tasso metabolico e le dimensioni di un organismo siano legati da una potenza 3/4 può essere visto da un certo punto di vista come un compromesso tra una relazione lineare (pendenza della retta 1) e la relazione superficie-volume (pendenza 2/3). Questo compromesso è dettato da due caratteristiche principali del problema “dei rifornimenti”.

Per capire il primo immaginiamo di voler “ingrandire” un piccolo mammifero: aumentando le sue dimensioni, aumenteremo il suo numero di cellule, perciò dovremo rendere più efficiente il suo sistema circolatorio. Per fare ciò dovremo, fra il resto, aumentare la superficie dei suoi vasi sanguigni, perciò ci saranno delle cellule in più che oltre ad aumentare questa superficie aumenteranno anche il volume dell’organismo in sè! Quindi una parte del volume della crescita è occupato dal sistema di rifornimento di quelle cellule che hanno determinato l’aumento. In altre parole, se raddoppiamo il numero di cellule che hanno bisogno di essere nutrite e ossigenate il volume di quella che potremmo chiamare rete di distribuzione aumenterà più del doppio perchè serviranno più collegamenti e quei collegamenti occupano un certo volume.

La rete di distribuzione di ossigeno in un gran numero di organismi pluricellulari

L’altra ipotesi che gioca un ruolo importante nel compromesso tra linearità e rapporto superficie-volume  consiste nel considerare che il metodo più efficiente di trasporto (quello associato con meno sprechi) è quello che occupa una frazione fissa del volume totale dell’organismo.  Quest’ipotesi deriva principalmente da osservazioni empiriche: nel caso dei mammiferi  questa frazione è del 6-7%.

Mettere insieme queste due ipotesi dal punto di vista matematico non è semplice, ma partendo da questi due punti (successivamente altri ricercatori hanno utilizzato ipotesi meno restrittive) si può dimostrare che il rapporto di massima efficienza è pari a 3/4 ed è ciò che effettivamente si osserva.

La potenza di questa legge penso che sia evidente: è una legge che vale per organismi molto diversi tra loro ed è nella sua essenza incredibilmente semplice. Nonostante ci siano tutt’ora alcuni critici, questa derivazione è accettata dalla maggior parte degli ecologi e continua ad affascinare per la sua eleganza e generalità.

Per approfondire:

Methabolic Theory of Ecology on Wikipedia. Dalla legge di Kleiber si è sviluppata un’intera branca dell’ecologia.

Power Laws in Biology un articolo interessante sulle leggi di potenza in biologia, descrive molti dettagli da cui si può capire l’importanza di utilizzare la scala logaritmica in questo ambito

Of Mice and Elephants: A Matter of Scale, George Johnson, un’interessante e appassionante introduzione al lavoro di West, Brown ed Enquist

The Ancestor’s Tale, Richard Dawkins, ai temi delle leggi di scala in biologia e alla legge di Kleiber Dawkins dedica ben due racconti (Il racconto dell’homo abilis e del cavolfiore)

Dimensioni e vita, McMahon- Bonner, Una bella raccolta di esempi e problemi che riguardano dimensioni e biologia, non troppo appassionante da leggere, ma molto interessante.


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The Hallmarks of Cancer

3 aprile 2011 in lente di barlow by Manuel | 2 comments

Nel lontano anno 2000 uscì su Cell, una importante rivista scientifica nell’ambito della biologia cellulare e molecolare, una review di due ricercatori statunitensi, Douglas Hanahan e Robert Weinberg, intitolata “The hallmarks of Cancer”. Hallmark, in italiano, è traducibile con caratteristica, proprietà. Qualche settimana fa, è uscito dagli stessi autori sulla stessa rivista la seconda puntata: “The hallmarks of cancer: The next generation”. Non vi stupite che siano passati dieci anni tra la prima e la seconda pubblicazione. Dieci anni è un tempo minimo perchè si possano tirare le somme degli esperimenti fatti fino a quel momento.
Questi due articoli segnano, diciamo, una sorta di punto di arrivo della ricerca svolta per più di trent’anni nell’ambito del cancro.
Nel primo articolo i due autori, mettendo assieme tutti i dati ottenuti, sono passati in rassegna a quelle che appunto loro definicono The hallmarks of cancer, le caratteristiche principali che la stragrande maggioranza dei tumori acquisice per potersi sviluppare. Ed è appunto proprio di queste caratteristiche che ci andremo ad occupare, e vedremo come una grandissima quantità di fenotipi tumorali che a prima vista sembrerebbero scorrelati e disordinati, in realtà rientrano in almeno una di queste caratteristiche.
I tumori sono malattie genetiche delle cellule somatiche. Partiamo da questo fatto. Si sottolinea che è delle cellule somatiche perchè la maggiorparte delle neoplasie è sporadica, ovvero non ereditata. Che poi anche qui bisogna precisare. Anche nei casi in cui è dimostrabile una familiarità di alcuni tipi di tumori (tumori, cioè, in cui l’incidenza in un gruppo di consanguinei è più alta che nella popolazione generale), ad essere ereditata non è la neoplasia, ma la predisposizione ad essa. Che è ben diverso. Uno eredita l’anemia, la fibrosi cistica, non eredita un tumore. Sperando che quanto detto fino ad ora sia chiaro, possiamo capire come le caratteristiche di un tumore siano uniche nel loro genere. Non troveremo mai un tumore identico ad un altro, anche se molto simile. Tuttavia si può dire che ciascun tumore, per essere tale deve possere una serie di caratteristiche che possonono essere dette universali. Nella prima versione, quella del 2000, le caratteristiche in questione erano sei.
Un tumore, per essere tale, deve avere una autosufficienza nella proliferazione cellulare. Le cellule tumorali, cioè, non hanno bisogno di stimoli esterni per proliferare. Normalmente le cellule non proliferano se non sono stimolate dai cosiddetti fattori di crescita, molecole che legandosi a dei Recettori specificiesposti sulla membrana plasmatica, li attivano. L’attivazione di questi recettori fa sì che nel nucleo della cellula, attraverso un complesso e sofisticato pattern di proteine, vengano attivati specifici geni le cui proteine fanno entrare in divisione la cellula. Quindi, in seguito ad uno stimolo esterno (fattore di crescita) la cellula risponde attraverso la divisione cellulare. Normalmente la disponibilità di questi fattori di crescita è limitata, e se anche dovesse eccedere si instaura un circuito (Feedback) negativo che blocca la cellula. Una cellula tumorale, invece, non ha bisogno di questi fattori di crescita per proliferare, non solo, è anche insensibile ai segnali antiproliferativi. Così come ci sono i fattori di crescita, esistono anche dei fattori che inibiscono la proliferazione. Fisiologicamente quello che cambia è il rapporto dei primi rispetto ai secondi. Una cellula tumorale è autosufficiente riguardo ai primi, non ne ha cioè bisogno, ed è insensibile ai secondi. Questo pone un bel problema. Una cellula tumorale è una cellula che l’organismo non può più controllare. Le basi molecolari di questo fenomeno sono note da tempo. Sono state infatti riscontrate moltissime mutazioni a livello dei geni dei recettori dei fattori di crescita. Queste mutazioni hanno come risultato che la proteina che formerà il recettore stesso sia in una condizione di perenne attivazione anche in assenza dei fattori di crescita. Questo fa sì che la cellula riceva costantemente segnali proliferativi, e continui così a dividersi. Oltre che al recettore, che è la componente più a monte della via di segnalazione, sono spesso mutate proteine a valle rendendo la situazione ancora più complicata. In questo caso, infatti possono essere mutate ed iperattivate proteine che inducono la proliferazione, oppure possono essere mutate proteine che inibiscono la proliferazione, ma in questo caso siamo di fronte ad una mutazione inattivante. E’ come se avessimo un’automobile, in cui o l’acceleratore è costantemente premuto oppure è rotto il sistema frenante. Meglio ancora se capitano entrambe le cose. I geni che codificano proteine che accelerano la cellula, sono chiamati Proto-Oncogeni. I geni che codificano proteine frenanti sono chiamati oncosoppressori. I primi vengono mutati ed iperattivati, o in qualche modo iperespressi, e diventano Oncogeni Attivati i secondi vengono inattivati o silenziati.
La via di segnalazione più spesso coinvolta nella proliferazione cellulare è quella di RAS-RAF-MAP KINASES, che è rappresentata da questa figura:

Cell signaling

Come potete vedere, a parte la complessità del sistema che è notevole, e che viene soltanto in parte realizzata in questa immagine, La via di segnalazione inizia in alto, da quel recettore rosso chiamato RTKs (Receptors Tyrosine Kinase). A questo recettore si lega il fattore di crescita (il triangolino) e lo attiva. Da questo recettore attraverso due proteine GRB2 e SOS, (in grigio e in arancione rispettivamente a fianco al recettore) si attiva la èproteina RAS, in violetto (le frecce indicano un’attivazione). RAS, in alternativa ai Recettori dei fattori di crescita, è trovato molto spesso mutato in cellule tumorali ed è un importantissimo oncogene, in quanto si trova a valle del recettore, e anche se il recettore è normale, RAS iperattivato risulta in una continua segnalazione proliferativa all’interno della cellula. In quanto RAS, seguendo la linea verticale attiva a sua volta RAF (oncogene anch’esso), RAF attiva MEK, che attiva ERK, che a sua volta attiva la trascrizione di numerosi geni coinvolti nella sopravvivenza e proliferazione. In questa via di segnalazione quindi, abbiamo diversi nodi che, se iperattivati, inducono la cellula a proliferare incontrollatamente.
Il terzo hallmark preso in considerazione è la capacità di evadere l’apoptosi. L’apoptosi è il meccanismo con cui una cellula, se danneggiata, privata dei fattori di crescita, o semplicemente “vecchia” muore. E’ un meccansimo regolato geneticamente ed è un evento fisiologico. I geni coinvolti in questo processo si distinguono in Proapoptotici (che sono, alla fine, degli oncosoppressori) e Antiapoptotici (che sono dei proto-oncogeni). E’ stato dimostrato che la capacità di evadere l’apoptosi è una caratteristica di probabilmente tutti i tipi tumorali.
A questo punto bisogna aprire una parentesi. Per molto tempo si è sempre pensato che sopravvivenza/proliferazione cellulare ed apoptosi fossero due processi nettamente differenziati e separati tra di loro, perchè per la nostra mente nulla ci può essere di più diverso dalla vita che la morte. Scoprire quindi che alcuni geni che tendenzialmente si credeva fossero coinvolti in un processo sono ugualmente coinvolti nell’altro ha creato scompiglio. C’è quindi una sovrapposizione molecolare tra sopravvivenza e morte cellulare. In particolare in un processo che viene definito “Oncogene-induced Apoptosis” abbiamo che se abbiamo un’iperattivazione di un proto-oncogene in Oncogene, nella maggiorparte dei casi si ha l’effetto contrario a quello che ci si aspetterebbe, ovvero la cellula, al posto di sopravvivere e/o proliferare, va in apoptosi. Questo è un meccansimo di controllo e sicurezza non da poco. Per questo i Tumori per potesi sviluppare devono contemporaneamente attivare la proliferazione e inibire l’apoptosi!
La quarta proprietà acquisita dalla maggiorparte delle cellule tumorali è l’immortalizzazione. Ho già fatto presente in diversi post che le cellule normali hanno un potenziale replicativo limitato. Ovvero dopo un certo numero di divisoni cellulari si bloccano, entrano in una fase chiamata senescenza e vanno incontro ad apoptosi. Questo è dovuto al fatto che le regioni terminali dei cromosomi, i telomeri, si accorciano di divisione in divisione, fino a raggiungere una lunghezza critica che blocca la cellula. Questo orologio biologico è molto importante, e solo le cellule staminali e quelle germinali hanno la capacità di rigenerare i telomeri e quindi replicarsi indefinitamente. Questo perchè esprimono un enzima, la Telomerasi che è in grado di allungare le estremità telomeriche. Anche una cellula tumorale deve essere in grado di replicarsi indefinitamente (almeno potenzialmente), e per questo devono esprimere il gene della telomerasi che normalmente viene espresso solo dalle cellule staminali e viene silenziato man mano che la cellula figlia si differenzia e perde la staminalità. Una cellula tumorale, quindi, può, in linea teorica, replicarsi in eterno.
Gli ultimi due Hallmarks sono in qualche modo correlati tra loro. Il quinto, infatti, riguarda la capacità di stimolare l’angiogenesi. Cos’è l’angiogenesi? Questo processo dal nome così strano è la capacità di stimolare la formazione di vasi sanguigni nuovi (capillari, per lo più) a partire da vasi pre-esistenti. Questa è una condizione sine qua non. Se le cellule tumorali (o almeno una loro sottopopolazione) non sono in grado di stimolare le cellule dei vasi sanguigni (cellule endoteliali) a proliferare e a formare nuovi vasi in direzione del tumore stesso, il tumore necessariamente regredirà. Se il tumore non riesce a farsi vascolarizzare sufficientemente, non sarà in grado di assorbire i nutrienti necessari alla proliferazione. In molti casi le cellule tumorali secernono dei Fattori pro-angiogenetici (che alla fine sono una sottoclasse dei fattori di crescita) che raggiungono i capillari circostanti e li inducono ad ulteriore sviluppo.
Infine, molti tipi di tumori, anche se non tutti, sono in grado di diffondersi attraverso i vasi sanguigni e linfatici e colonizzare altri tessuti, formando le metastasi. Le metastasi sono quindi originate da cellule del tumore primitivo che si staccano dalla massa originaria, entrano nei vasi sanguigni e colonizzano altri tessuti formando tumori secondari. Un tumore che ha già dato metastasi è ormai agli ultimi stadi, e come tale avrà una prognosi peggiore rispetto ad un tumore non diffuso.
Questi, quindi, sono i sei punti chiave che è stato dimostrato che sono comuni alla stragrande maggioranza dei tumori. Le vie attraverso le quali una cellula tumorale acquisisce queste capacità possono essere diverse, ma alla fine è il risultato quello che conta.
Nella versione aggiornata del 2011, i due autori hanno individuato altre quattro caratteristiche salienti:
-Evitare la distruzione da parte del sistema immunitario
-L’infiammazione come elemento che favorisce il tumore (a questo riguardo si potrebbe scrivere un trattato, ma ora come ora lo rimanderei)
-Marcata instabilità genomica, come ho scritto nel post precedente a questo, le cellule hanno una serie di meccanismi che riparano il DNA e lo preservano dalle mutazioni. Le mutazioni sono ciò che, alla fine, rende possibile alle cellule l’acquisizione di queste caratteristiche fino ad ora discusse. Se abbiamo una stabilità genomica ridotta, avremo un tasso più elevato di mutazioni e una probabilità maggiore di sviluppare tumori.
-Alterato metabolismo: le cellule tumorali hanno un metabolismo energetico profondamente alterato che rende loro possibile ricavare grandi quantità di energia anche in condizioni proibitive per le altre cellule.

Tutto questo, quindi, mette in evidenza come si possano comunque tracciare delle linee generali che in qualche modo mettano un po’ di ordine nel complesso mondo dell’oncologia molecolare. Spero di essere stato chiaro, e non eccessivamente noioso. Come sempre vi esorto a fare domande se ne avete o correzioni!

Alla prossima!

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Come la Casualità gioca a nostro favore

10 febbraio 2011 in lente di barlow by Manuel | 12 comments

Finalmente sono tornato! Non ero morto nel frattempo. Il mio ultimo Post risale a più di un mese fa, è ora che io mi decida a scrivere il prossimo. Se non altro sono avvantaggiato, so già di cosa parlerà. Il mio ultimo post riguardava L’immunosorveglianza e l’immunoterapia come possibile arma nella battaglia contro il cancro. E mi era stata fatta una domanda, e ringrazio chi me l’ha fatta, riguardante il funzionamento del sistema immunitario, in particolare: “qual è l’origine della diversificazione del sistema immunitario?”. Il fulcro della discussione sarà incentrato quindi sulle cellule dell’immunità specifica:
I Linfociti B e i Linfociti T. Essi provengono da uno stesso precursore staminale, chiamato precursore Linfoide, che attraverso delle divisioni cellulari, darà origine a delle cellule che man mano si differenzieranno o in B o in T.
I Linfociti B ricordo che sono le cellule che producono gli anticorpi, mentre i Linfociti T hanno molte funzioni, tra cui regolare la risposta immunitaria, riconoscere cellule infette ed eliminarle, ecc…
I primi completano il loro differenziamento nel midollo osseo (B sta per Bone marrow, midollo osseo appunto) i secondi nel Timo. All’inizio quindi, non c’è differenza, poi man mano che i cloni si differenziano, prendono una strada piuttosto che un’altra. Ovviamente, come potrete capire, si tratta di un aut aut.
Durante il processo di maturazione verranno espressi i geni che codificano per il recettore dei linfociti B (BCR) e il recettore dei linfociti T (TCR). Questi due recettori sono i responsabili della specificità e della diversificazione del sistema immunitario. Ciascun recettore di ciascun linfocita è specifico per uno e uno solo antigene, e questa specificità è dovuta alla diversità del sito di legame del recettore con l’antigene.
A questo punto sorge spontanea una domanda. Se i geni del recettore per l’antigene sono uguali per ogni clone linfocitario di un organismo, come si genera questa diversità recettoriale? Qui entra in gioco un processo fondamentale, che pochissimi tipi cellulari sono in grado di eseguire,la Ricombinazione Genetica. Ho già scritto un post in merito alla ricombinazione: Knok Out. Ne cito alcuni passaggi per rinfrescare la memoria.

“È un processo che prevede lo scambio di due o più segmenti genici. Può avvenire all’interno dello stesso cromosoma o avvenire tra due cromosomi diversi. La ricombinazione è uno dei meccanismi attraverso il quale si forma la variabilità genetica. Uno dei più importanti eventi di ricombinazione avviene durante la meiosi (quando cioè i progenitori delle cellule germinali si dividono dando origine ai gameti); in questo caso viene anche chiamata crossing over ed è il meccanismo con il quale segmenti di DNA vengono scambiati tra due cromosomi omologhi. Questo è per creare gameti con un genotipo diverso da quello delle cellule di partenza.”

Oltre al crossing over, che avviene nei gameti, abbiamo la ricombinazione somatica che avviene nei linfociti. (somatica perché avviene in cellule somatiche e non germinali). Il meccanismo di base è lo stesso, cambia ovviamente il soggetto e il risultato. (tra l’altro, sempre nel post Knock out, spiego come è possibile usando la ricombinazione ottenere delle mappe cromosomiche dei geni, se vi interessa.. mi faccio anche la pubblicità).
Prendiamo come esempio il BCR. Il BCR è un recettore che appartiene alla famiglia delle Immunoglobuline, ovvero degli anticorpi. Anzi, esso stesso è un anticorpo, e la sua funzione è la stessa, ma a differenza di un anticorpo non viene liberato all’esterno, ma rimane fissato alla membrana cellulare. Quindi alla fine, gli anticorpi vengono sintetizzati a partire dagli stessi geni utilizzati per il recettore.
Per spiegare l’organizzazione dei geni del BCR, indispensabile per capire la ricombinazione somatica, faccio il percorso inverso, parto dalla proteina e arrivo al gene.
Come è fatto un BCR, e quindi un anticorpo? Sono delle proteine multimeriche, formate da più subunità proteiche, ciascuna codificata dal proprio gene. In particolare, sono costituiti da due catene proteiche pesanti, identiche tra loro associate. Ciascuna catena proteica pesante è a sua volta associata con una catena più leggera. In totale due catene pesanti, identiche, e due catene leggere, identiche. Sia le catene pesanti che quelle leggere sono divisibili in due sottoregioni, una variabile, ed una costante. L’associazione delle regioni variabili delle catene pesanti con quelle leggere formano la tasca di legame con l’antigene. Ciascun anticorpo avrà quindi due siti di legame identici per l’antigene perchè ci sono due coppie di catene pesanti e leggere. Per farvi un’idea potete dare un’occhiata a questo Link , che vi mostra, oltre alla struttura quaternaria della proteina (la prima immagine), anche uno schema più comprenibile della struttura dell’anticorpo.
Gli anticorpi possono inoltre essere di classi diverse (le classi si chiamano isotipi), ciascun isotipo si differenzia dall’altro per la porzione costante delle catene pesanti. Pertanto esistono gli anticorpi di classe A, D, E, G e M. Anche le catene leggere hanno due classi, K e λ. Tutto questo è molto mnemonico, ma necessario. Adesso arriva la parte divertente.
Esistono un gene che codifica per la catena K, uno per quella λ mentre tutte le catene pesanti sono codificate da un unico gene, o locus. Ciascuno di questi geni ha tre regioni, chiamate in ordine V, J e C. Il gene delle catene pesanti ha anche la regione D. Ciascuna regione, in ordine V, D, J e C contiene a sua volta delle sotto regioni, separate da DNA non codificante. Ad esempio il gene K leggo che ha circa 35 regioni V. Ciascun tratto V è diverso da tutti gli altri. Le regioni V(D) e J vanno a costituire la regione variabili delle catene, mentre la regione C quella costante.
La ricombinazione somatica cosa fa? Attraverso due enzimi RAG1 e RAG2 i cui geni vengono espressi solo durante la maturazione linfocitaria, vengono congiunte casualmente una regione V, una regione D ed una regione J, eliminando le sequenze interposte. Viene a crearsi una regione VDJ (o VJ per le catene leggere), che è praticamente unica nel suo genere, perché ottenuta mediante l’unione casuale dei segmenti genici V, D e J. Ci sono delle sequenze di riconoscimento per evitare che si giustappongano sequenze sbagliate. Inoltre la ricombinazione avviene soltanto su uno dei due alleli per ogni gene, in modo da evitare la sintesi di due recettori diversi. E se, ad esempio, viene ricombinato il gene λ, il gene K viene represso per evitare la sintesi di due catene leggere diverse.
Mentre per le catene leggere il discorso finisce qua, per le catene pesanti c’è ancora il discorso dell’isotipo. Il segmento genico unito VDJ viene trascritto dalla RNA polimerasi II in un RNA messaggero fino alle regioni C più prossimali. Abbiamo detto che la regione costante determina l’isotipo. Le regioni ci più prossimali sono quella M e quella D, quindi il primo isotipo che viene sintetizzato è di classe M o di classe D. entrambi gli isotipi possono venire espressi da una stessa cellula Avremo quindi una proteina formata da due catene pesanti identiche ricombinate, e da due catene leggere ricombinate anch’esse, o K o λ.
Tutti i Linfociti B, all’inizio, esprimono recettori di classe M e/o D sulla loro membrana. Quando una cellula B matura incontra per la prima volta il suo antigene specifico si attiva, e lo scopo dell’attivazione è quello di produrre anticorpi, che come ho detto, sono identici al BCR, solo che non sono inseriti nella membrana cellulare ma vengono rilasciati all’esterno. Durante l’attivazione il clone B va incontro a divisioni cellulari che porteranno alla formazione di due tipi di cellule: i cloni memoria e le plasmacellule. I primi rimangono silenti nell’organismo fino ad un successivo contatto con l’antigene, nel qual caso si riattivano e iniziano una nuova risposta immunitaria; le seconde hanno una vita limitata durante la quale producono grandi quantità di anticorpi. Durante l’attivazione è possibile che le plasmacellule vadano incontro allo scambio dell’isotipo della catena pesante, ovvero, attraverso un secondo evento di ricombinazione che porta alla congiunzione del segmento VDJ già ricombinato con un segmento C diverso da M o da D (A, E o G), eliminando tutto il segmento di DNA tra VDJ e il segmento C prescelto. Per cui, avremo una catena pesante che ha la stessa specificità per l’antigene, ma un diverso isotipo e quindi diverse proprietà. Una volta effettuato lo scambio dell’isotipo, quella plasmacellula non potrà più cambiarlo, e continuerà a sintetizzare anticorpi di quell’isotipo. Siccome le plasmacellule saranno molte, ci saranno scambi di isotipi diversi, e quindi avremo contro uno stesso antigene anticorpi con isotipi diversi.
Un discorso Analogo, anche se leggermente diverso vale per il recettore dei Linfociti T. Riassumo quindi i diversi processi che portano alla diversificazione dei BCR, e in modo analogo dei TCR:
1) Diversità combinatoria: La ricombinazione di n segmenti V, m segmenti D e x segmenti J in modo del tutto casuale.
2) Giustapposizione di un qualsiasi VDJ della catena pesante ed un qualsiasi VJ di una catena leggera
3) Non paghi di questo, durante la ricombinazione possiamo avere a livello delle giunzioni tra segmento V e il segmento D, e tra quest’ultimo e il segmento J l’aggiunta o la perdita casuale di alcuni nucleotidi. Cosicché se anche due BCR avessero lo stesso segmento VDJ non sarebbero comunque uguali.

La sintesi del BCR e del TCR è un processo centrale della maturazione linfocitaria. Se un clone non dovesse riuscire ad esprimere il suo recettore andrebbe incontro all’ Apoptosi. Inoltre, poichè le combinazioni sono casuali, possono uscire fuori delle combinazioni difettose, nel qual caso la cellula verrebbe comunque destinata all’apoptosi così come se il recettore risultasse specifico ad un antigene del self, in modo da evitare che il sistema immunitario si attivi contro l’organismo stesso (Tolleranza).

So che è stato un post lungo, difficile e magari anche noioso, ma spero di essere riuscito a trasmettere l’incredibile raffinatezza e complicatezza del processo. Se avete domande o se notate errori usate i commenti!

Alla prossima!

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