Quello che spiegherò invece è la struttura del genoma retrovirale; un retrovirus ha un genoma a RNA a singolo filamento. Alle estremità di questo filamento ci sono due sequenze terminali diverse, una sequenza terminale 5′ costituita da una regione chiamata R e una regione chiamata U5, e una sequenza terminale 3′, costituita da una sequenza chiamata U3 e una copia identica della sequenza R.

R-U5_________________(RNA a singolo filamento)_______________U3-R

Queste sequenze (R-U5 e U3-R) sono estremamente importanti sia nell’integrazione del genoma virale (retrotrascritto poi in DNA), sia nell’espressione dei geni virali da parte di fattori di trascrizione dell’ospite. Durante la retrotrascrizione, il processo col quale il Genoma virale di RNA a singolo filamento viene trasformato in un genoma a DNA a doppio filamento (leggere il post Retrovirus), vengono aggiunte dei pezzettini al genoma in costruzione, e queste sequenze sono rispettivamente la sequenza U3 al 5′ (prima della sequenza R) e di U5 al 3′, (dopo la sequenza R). In questo modo, quelle che nel genoma a RNA erano sequenze terminali diverse (R+U5 vs U3+R), ora sono diventate delle sequenze terminali identiche (U3-R-U5 e U3-R-U5) Queste sequenze sono chiamate LTR, Long terminal Repeats.

U3-R-U5_____________(DNA a doppio Filamento)______________U3-R-U5

All’interno del genoma, tra queste due LTR ci sono ovviamente i geni retrovirali. I tre geni più importanti sono chiamati Gag, env e pol, che codificano ciascuno per diverse proteine. Il gene gag codifica per le proteine del capside virale, Env codifica per le proteine dell’envelope e Pol codifca per proteine come la retrotrascrittasi, l’integrasi e la proteasi.
La trascrizione di questi geni inizia una volta che il Genoma a DNA si è integrato. I trascritti possono Monocistronici (ovvero contenere un solo gene) oppure policistronici. La maturazione delle proteine virali avviene poi attraverso la proteasi che dai precursori genera le proteine definitive.
Oltre a Gag, Pol e env, ci sono anche altri geni accessori che possono variare da retrovirus a retrovirus, e hanno il compito di facilitare l’operato del virus, molto famosa è, nell’HIV, la proteina Tat, codificata dal gene omonimo, che è un trans-attivatore, ovvero è una proteina che durante la trascrizione del genoma del virus integrato, si lega al trascritto nascente e permette di aumentare l’efficienza della trascrizione stessa consentendo la produzione di trascritti full-lenght, senza questa proteina il virus sarebbe in grado di sintetizzare solo messaggeri troppo corti.

Un vettore retrovirale sfrutta la capactà dei retrovirus di INFETTARE le cellule e di INTEGRARE il loro genoma in quello delle cellule ospiti. In questo modo possiamo trasferire e far esprimere geni che vogliamo ai nostri modelli sperimentali (linee cellulari, animali) in maniera permanente e stabile. Quello che ci serve prima di tutto è quindi il genoma di un retrovirus, all’interno di questo genoma che è solitamente lungo una decina di kilobasi, dobbiamo inserire il gene di interesse. I problemi sono 2, il primo è che la somma tra il genoma retrovirale e il gene di interesse non deve superare una soglia critica, perchè altrimenti il vettore non potrà essere inserito all’interno del virus (capside) stesso per motivi di spazio. Il secondo è che non possiamo lavorare con il genoma ad RNA. Per il primo problema si è fatto sì che si sviluppassero dei vettori retrovirali estremamente ridotti, ovvero contenenti soltanto le LTR terminali ed una sequenza molto importante chiamata di incapsidamento (spiegherò dopo il significato). In questo modo, avendo eliminato tutti i geni retrovirali, io posso inserire all’interno delle LTR il mio gene di interesse. Il secondo problema è stato aggirato lavorando su vettore retrovirale in DNA. Tra tutti i vettori retrovirali, i più diffusi sono quelli lentivirali (i lentivirus sono una sottoclasse dei retrovirus)

In questo Vettore retrovirale abbiamo le due sequenze LTR, e una sequenza Psi che è la sequenza di incapsidamento. Dopodichè abbiamo due geni, uno che codifica una proteina che conferisce resistenza all’ampicillina esterno alle LTR, e un altro che codifica una proteina che conferisce resistenza ad un altro antibiotico, la neomicina che è interno alle LTR e sotto un promotore specifico SV-40 (SV-40 è un promotore appartenente ad un virus delle scimmie, ma non un retrovirus). Che cosa servono questi due geni di resistenza antibiotica? Servono per selezionare. Per iniziare, devo trovare il sistema per inserire il gene di interesse nel vettore di cui vedete sopra un’immagine (esistono tantissimi tipi di vettori retrovirali, e lentivirali in particolar modo). Il modo tradizionale consiste nell’usare degli enzimi di restrizione. Un enzima di restrizione è un enzima che taglia un doppio filamento di DNA, riconoscendo una specifica sequenza. Se io taglio il mio vettore, con un enzima che riconosca una sequenza una sola volta, e che quindi faccia un solo taglio (Per fare questo c’è una mappa di restrizione che indica i diversi siti di taglio presenti sul vettore), e in particolar modo riconosca una sequenza presente nella regione chiamata MCS, io aprirò il mio vettore, lo renderò una molecola di DNA lineare. Il taglio deve generare preferibilmente delle sticky ends, in modo che, usando lo stesso enzima per il mio gene di interesse (facendo attenzione che non lo tagli in mezzo, ma solo alle estremità), Io potrò incastrare il mio gene di interesse all’interno del mio vettore linearizzato proprio perchè avranno le estremità complementari. Legando il mio gene al mio vettore, questo si ricircolarizzerà, generando una molecola di DNA circolare con dentro il mio gene. Il gene è inoltre stato inserito in mezzo alle due LTR retrovirali (perchè ho utilizzato un enzima che tagliasse nel MCS). Ci sono inoltre dei metodi per inserire il gene nella direzione giusta, in modo che sia sotto il controllo del giusto promotore retrovirale (clonaggio direzionale).
Dopodichè si utilizzano dei batteri, all’interno dei quali inseriamo il nostro vettore per aumentarne la quantità. Solo i batteri che hanno assunto il vettore saranno in grado di crescere in un terreno contenente ampicillina, in questo modo io seleziono esclusivamente i batteri che mi servono, quelli che hanno il vettore. La domanda che potreste fare è: ma se visto che ho due geni che danno la resistenza due antibiotici diversi, uno chiaramente per i batteri e l’altro per le cellule eucarioti, sono interscambiabili? Posso cioè utilizzare la neomicina per selezionare i batteri anzichè l’ampicillina? la risposta è no, perchè in questo caso il gene della resistenza alla neomicina è sotto un promotore specifico per le cellule eucarioti, e i batteri non lo leggerebbero, per cui i batteri non sono resistenti alla neomicina, mentre le cellule eucarioti non sono sensibili all’antibiotico ampicillina per cui la selezione invertita non funzionerebbe.
Una volta ottenute grandi quantità di vettore, devo passare allo step successivo. Ovvero creare il retrovirus che contenga come genoma il mio vettore che ho appena costruito. Per fare questo devo tenere conto di diverse cose. innanzitutto, il mio vettore retrovirale, che ho appena costruito da solo non è in grado di produrre nessun virus visto che gli mancano tutti i geni (che gli sono stati tolti per far spazio al gene di mio interesse). Pertanto devo utilizzare un sistema di vicariaggio, ovvero inserire artificilamente il mio vettore appena fatto in cellule apposta (trasfezione). Queste cellule sono chiamate cellule Helper, poichè portano al loro interno tutti i geni retrovirali necessari (gag, env, pol ecc) ma senza la sequenza di incapsidamento. Quindi le cellule helper sono in grado di fornire al mio vettore le proteine neccessarie a integrarsi e trascriversi, sono in grado fabbricare le proteine strutturali virali e quindi di fabbricare il corpo del virus all’interno del quale dovrà incapsidarsi il nostro vettore di interesse. A questo punto entra in gioco il secondo fattore, ovvero la sequenza di incapsidamento: mentre il vettore che contiene il gene di mio interesse contiene la sequenza di incapsidamento, quello che fornisce le proteine retrovirali no, pertanto è impossibile che si vengano a creare dei virus contenenti il vettore con gag env e pol, ma solo quello contenente il gene che voglio. Le cellule Helper sono ottenute infettando delle cellule con un retrovirus privato della sequenza psi; con i primi protocolli accadeva che durante il processo di produzione dei retrovirus, si generassero spontaneamente dei retrovirus replicazione competenti (al contrario di quelli che si volevano ottenere, dei virus replicazione-incompetenti); questa reversione spontanea era dovuta ad eventi di ricombinazione tra il vettore col gene di mio interesse e il vettore con i geni virali standard privato della sequenza psi. Per ovviare a questo problema, si iniziò a transfettare le cellule Helper con vettori separati: uno che codifica per i geni gag-pol, ed un secondo vettore che contiene invece il gene env. Il gene env è molto importante perchè codifica per le proteine di superficie, quelle dell’envelope, che sono le proteine con cui il virus riconosce le cellule e le infetta. Il gene env quindi detrmina la specificità (tropismo) del virus nei confronti dell’ospite. Oltre a questo accorgimento si iniziarono a togliere tutte le sequenze non indispensabili dai vettori helper, per ridurre la probabilità di ricombinazione.
Quindi alla fine della fiera, io inserisco il mio vettore retrovirale nelle cellule helper, e queste cellule helper dopo alcuni giorni di incubazione mi daranno numerose particelle virali contenenti il vettore di mio interesse, anche se sulla totatilità solo una percentuale sarà effettivamente attiva (alcune particelle potranno infatti essere vuote). Io quindi prelevo dal terreno di coltura di queste celluel helper i miei virus, e posso usarlo per infettare le mie cellule. Il virus che ho ottenuto, sarà quindi come stabilito, replicazione incompetente perchè il suo genoma non è in grado di produrre le proteine virali, questo fa sì che quando utilizzerò il virus appena prodotto per infettare le cellule designate, che non sono più cellule helper, ma cellule normali, si avrà soltanto il processo di infezione, di retrotrascrizione e di integrazione del genoma virale e non si avrà nessuna produzione di virus. Ovviamente le cellule da infettare devono essere compatibili con il virus ottenuto, e la compatibilità è data, come ho detto prima, dalle proteine dell’envelope.
Quindi, lo step finale è quello di utilizzare i virus prodotti per infettare le cellule, normalmente quello che si fa è di creare sia un controllo positivo che un controllo negativo. Il controllo positivo può essere un retrovirus contenete nel suo genoma il gene della GFP, in modo che questo renda facile la quantificazione dell’efficienza di infezione (in base al numero di cellule con la fluorescenza verde). Il controllo negativo è un vettore retrovirale vuoto, senza nessun gene inserito, questo serve a controllare gli effetti dell’integrazione casuale che il genoma retrovirale subisce. Inoltre, le cellule infettate col virus vengono fatte crescere in un terreno contenente neomicina (nel caso del vettore in figura), per selezionare solo le cellule che hanno integrato il vettore. Le cellule infettate quindi esprimeranno stabilmente il gene di mio interesse, e il vantaggio di usare vettori retrovirali è che l’efficienza di infezione è molto alta, molto più alta di qualsiasi altro metodo “gene-delivering”.

Ora, per finire, vorrei parlarvi delle apllicazioni pratiche di questo sistema. A cosa mi serve creare dei retrovirus per far esprimere geni di mio interesse? Beh, senz’altro a studiare gli effetti dell’espressione di uno o più geni in un sistema controllato. Ad esempio io trovo che in un particolare tipo di tumore ricorre una particolare mutazione in un gene specifico. Per dimostrare che questa mutazione sia o meno importante nella generazione del tumore, io posso utilizzare dei vettori retrovirali per infettare cellule che non esprimono quel gene con la forma mutata e con la forma standard e osservare le differenze di comportamento nelle cellule infettate.
Un altro campo di applicazione è la cosiddetta Gene-therapy, terapia genica, ovvero il tentativo di curare malattie attraverso l’espressione di geni estranei. Famoso è il caso del deficit di adenosina deaminasi (ADA-deficiency), una malattia genetica che causa una gravissima immunodeficienza congenita. Si è provato a prelevare le cellule staminali emopoietiche di bambini malati, e infettarle con un retrovirus contenente il gene dell’enzima ADA. Straordinariamente le cellule transgeniche, una volta reimmesse nel midollo osseo dei bambini, davano origine a cellule immunitarie funzionanti, eliminando così l’immunodeficienza. Questi sono rari casi di successo nei protocolli di terapia genica attualmente in corso. bisogna sottolineare come, essendo l’integrazione del virus casuale, questo possa rappresentare un rischio di mutagenesi-virus-indotta. Altre applicazioni consistono nell’utilizzare dei vettori retrovirali per far esprimere geni come l’insulina nei diabetici (in corso di sperimentazione), o di utilizzare questi vettori come “bombe” mirate a far suicidare le cellule tumorali (introducendo geni antiproliferativi come p53), il problema è quello di riuscire a costruire dei vettori specifici soltanto per le cellule tumorali.
Concludo con una nota sulla sicurezza in laboratorio durante la produzione di questi virus. Il pericolo maggiore per i ricercatori è quello ovviamente di infettarsi con il virus prodotto, questo ovviamente è tanto più possibile quanto più compatibile è il virus con l’essere umano. Per questo è obbligatorio seguire rigide preocedure di sicurezza (lavorare in laboratori attrezzati specificamente e adibiti apposta, lavorare sempre sotto cappa, indossare mascherina e indumenti protettivi ecc, buon senso)

Spero di non avervi annoiato! Se avete domande, usate i commenti!

In figura è possibile vedere una rappresentazione geometrica di parte del nostro problema, che trattiamo con le approssimazioni e le leggi dell’ottica geometrica. Assumendo che la luce si propaghi in linea retta possiamo vedere il raggio incidente in alto a sinistra arrivare all’interfaccia tra aria e acqua: parte di questa luce viene riflessa (ma per il momento non ce ne curiamo) e parte viene rifratta all’interno della goccia. Nella trasmissione tra un mezzo e un’altro l’angolo del raggio con la normale alla superficie cambia in base al rapporto tra gli indici di rifrazione da α a β. All’interno della goccia la luce viene trasmessa finchè non incontra un’altra interfaccia nel punto B dove viene nuovamente parzialmente rifratta e parzialmente riflessa. Questa volta ci concentriamo sulla componente riflessa, che secondo le leggi dell’ottica geometrica mantiene un angolo di β e si ritrasmette fino a C dove la componente che ci interessa (per ora) è quella trasmessa. L’angolo di deviazione del raggio uscente da quello incidente in A si può calcolare con le leggi citate sopra e con un po’ di geometria: δ=180°-2α+4β.

Un’osservazione importante è che δ non può avere qualsiasi valore (ricordiamo che la luce può colpire la goccia con molti angoli diversi) , ma (si può trovare derivando l’espressione o provando a mettere molti valori) presenta un valore minimo pari a un angolo di 137°-138°. Ciò significa che la luce che verrà complessivamente riflessa dalla goccia sarà tutta raccolta in un cono (anche perchè la goccia è simmetrica) di circa 42° di apertura. Questo risultato si può verificare osservando un arcobaleno con attenzione: l’interno dell’arco è sempre più luminoso dell’esterno.

In realtà con questo viaggio nella goccia di pioggia non si sono spiegati gli aspetti più salienti ovvero la forma e i colori. Cominciamo da questi ultimi: come probabilmente tutti sapete la luce bianca incidente, proveniente dal Sole, contiene già tutti i colori dello spettro. La goccia si comporta come un prisma, scomponendoli in un fenomeno detto dispersione. Questo comportamento della luce è legato al fatto che gli indici di rifrazione, che determinano gli angoli con cui viene rifratto il raggio, sono diversi per ogni  frequenza ovvero per ogni colore della luce. La principale conseguenza è quindi che ogni componente dello spettro avrà un cono di apertura leggermente diversa (la differenza è di pochi gradi °): all’interno di tutti i coni (nel volume che è intersezione di tutti i coni) rivedremo luce bianca, ma per angoli di apertura maggiore solo alcuni colori potranno essere “riflessi”.

Da queste figure (tratte da questo interessante sito) si dovrebbe avere un’idea intuitiva di cosa siano questi coni e come facciamo a vederli. In particolare modo dalla seconda immagine si capisce il motivo per cui la forma è quella di un arco e per cui per vedere un arcobaleno non basta una sola goccia d’acqua. Infatti, a seconda dell’angolo tra l’osservatore e la luce incidente dal Sole avremo una trasmissione fino all’occhio di luce bianca, di un determinato colore (a seconda del cono in cui si trova l’angolo) o nessuna luce (in realtà vediamo della luce diffusa, ma non quel raggio in particolare).

A questo punto, compreso il meccanismo di base, ci si possono porre problemi più complicati, ad esempio: come funzionano gli arcobaleni doppi? Se ritornate alla prima immagine, in cui si è studiato il percorso del raggio di luce all’interno della goccia d’acqua, ricorderete che in corrispondenza del punto C abbiamo trascurato la luce che veniva ulteriormente riflessa nell’acqua e ci siamo concentrati su ciò che viene rifratto. Se però ammettiamo che ci sia un’altra riflessione in C e studiamo gli angoli come fatto in precedenza si può scoprire che questa riflessione porta alla formazione di un secondo arco, i cui colori sono invertiti.

L’inversione dei colori riguarda anche le aree in cui la luce può arrivare o meno: l’area tra i due archi non riceve luce da nessuno dei due fenomeni perciò rimane più scura (si vede anche piuttosto bene dalle immagini) con la formazione delle cosiddette bande di Alessandro. Calcolando gli angoli ammessi si può inoltre osservare che è più largo rispetto a quello principale e osservando che la riflessione in C è meno probabile che la rifrazione l’arco secondario è meno intenso.

Insomma, come potete intuire a questo punto non c’è più limite alla vostra curiosità e creatività. L’ordine degli arcobaleni non si ferma infatti a 2, ma si tratta di archi sempre più flebili . Non finisce qui: si può parlare di arcobaleni gemelli, studiare la polarizzazione della luce degli arcobaleni, osservare arcobaleni lunari (chi lo dice che la luce debba venire dal Sole?) e così via…

Per chi volesse approfondire consiglio caldamento un video del MIT (in inglese) a cui mi sono pesantemente ispirata nella scrittura di questo post che approfondisce anche il discorso sulla polarizzazione. Un ottimo riferimento ricco di immagini e spunti per tutta l’ottica atmosferica merita sicuramente la vostra visita. Un altro sito di ottica atmosferica con qualche spiegazione in più.

Questo articolo deve essere letto dopo il precedente “Ci ossidiamo?”. Immagino sappiate tutti che all’inizio, agli albori della vita su questo pianeta l’ossigeno era assente o quasi, e l’atmosfera era composta da anidride carbonica, metano, ammoniaca, ecc… I primi organismi (batteri) erano quindi tutti esclusivamente anaerobi. Con l’avvento dei cianobatteri, i primi batteri fotosintetici, la vita cambiò radicalmente (ovviamente al passare di centinaia di milioni di anni). La fotosintesi vista dal punto di vista di un’equazione chimica è l’esatto contrario della demolizione degli zuccheri (ad es glucosio) ad anidride carbonica più acqua (cosa di cui ho parlato nell’articolo precedente), per cui avremo:

6CO₂ + 6H₂O -> C₆H₁₂O₆ + 6O₂

Utilizzando come materia prima dell’anidride carbonica e dell’acqua, molecole estremamente semplici, gli organismi fotosintetici sono in grado di sintetizzare zucchero, una molecola ben più complessa, il tutto sfruttando l’energia luminosa. Oltre allo zucchero viene immessa nell’ambiente una molecola di ossigeno, come fosse uno scarto (e in effetti da quest’ottica lo è). In questo modo iniziarono a svilupparsi organismi in grado di utilizzare l’ossigeno, che ora era abbondante nell’atmosfera, come accettore degli elettroni prelevati alle molecole ossidate. Questo permise di migliorare il rendimento energetico del metabolismo e diede senz’altro una spinta evolutiva. Ma l’ossigeno è una molecola che può diventare estremamente reattiva in grado di danneggiare le componenti della cellula e provocarne in certi casi la morte.
Parliamo dei radicali liberi e, nel caso dell’ossigeno, dei ROS (Reactive Oxygen Species). Per radicale intendiamo una specie chimica che presenta un elettrone spaiato nell’orbitale più esterno (Quindi presenta un numero dispari di elettroni). Questo rende la molecola o atomo estremamente instabile e del tutto propensa a reagire con altre molecole o con altri radicali. Esistono specie radicaliche con cariche elettriche mentre altre sono neutre e mentre le cariche elettriche vengono indicate con i segni + e -, la radicalità viene indicata con un pallino (•) per indicare l’elettrone spaiato. I radicali possono derivare da qualsiasi atomo o molecola, non solo dall’ossigeno. Uno degli eventi che portano alla formazione dei radicali è la Scissione Omolitica del legame: quando un legame chimico viene rotto e gli elettroni che formavano quel legame si dividono equamente tra un atomo e l’altro, abbiamo lo spaiamento degli elettroni e la formazione del radicale. Per fare un esempio, prendiamo una molecola di cloro che come l’ossigeno è biatomica; in seguito ad una scissione omolitica del legame tra i due atomi di cloro si formano due radicali, in quanto ciascun atomo di cloro ha un elettrone spaiato nel suo orbitale esterno:

Cl₂ -> 2Cl•

Questi due atomi ormai radicalizzati hanno una forte instabilità, e tendono a reagire con qualsiasi molecola proprio perchè questo elettrone spaiato tende o a sottrarne ad altre molecole o ad aggiungersi ad esse (reazioni di ossidoriduzione). Ad esempio se incontrano una molecola di metano, tendono ad ossidarlo:

CH₄ + Cl• -> CH₃• + HCl

Il radicale Cloro ha ossidato una molecola di metano sottraendogli un atomo di idrogeno (1 protone + 1 elettrone), in questo modo il radicale cloro si è stabilizzato ad acido cloridrico (HCl), ma come conseguenza si è radicalizzato il metano stesso, a cui è stato sottratto un atomo di idrogeno e il Carbonio si è quindi trovato con un elettron spaiato (prima coinvolto nel legame con H); la reazione continua con:

CH₃• + Cl₂ -> CH₃Cl + Cl•

Il radicale metilico ha successivamente reagito con una molecola di Cl biatomica, creando cloruro di metano e un nuovo radicale cloro. In questo modo abbiamo visto un’altra importante proprietà dei radicali, oltre quella di reagire con qualsiasi cosa passi per il convento, quella di autopropagarsi!
Che cosa può portare alla scissione omolitica? Ad esempio le Radiazioni Ionizzanti (ad esempio, nella prima reazione di radicalizzazione del cloro possono intervenire le RI), oppure energia termica oppure una reazione chimica di ossido-riduzione (come nell’ultima reazione tra il radicale metilico e il cloro).
Ma veniamo all’ossigeno. L’ossigeno essendo molto utilizzato dal nostro organismo è quello che più probabilmente darà origine a specie radicaliche ed è per questo che è molto pericoloso. Ha otto elettroni, e questa configurazione elettronica: 1s² 2s² 2p⁴, ma la particolarità è che ha ben due elettroni spaiati: un orbitale 2p ne alloca due, gli altri due uno ciascuno. I due elettroni spaiati rendono l’ossigeno particolarmente reattivo di suo e questo lo rende adatto come accettore finale degli elettroni (e anche, tra parentesi, alla formazione della molecola d’acqua):

O₂ + 4e^- + 4H⁺ -> 2H₂O

Gli elettroni, come ho detto nell’articolo precedente, provengono dalle molecole che venono ossidate durante il metabolismo. La riduzione dell’ossigeno ad acqua avviene nei mitocondri con l’acquisto di un elettrone alla volta. Può capitare che non avvenga la riduzione completa e che specie semi-ridotte fuggano nell’ambiente circostante sottoforma di radicali, questa è nè più nè meno che una normale conseguenza del nostro metabolismo ossidativo. Vediamo cosa accade, quindi:

O₂ + 1e^- + 1H⁺ -> HO₂•

Se l’ossigeno riceve solo un elettrone si riduce parzialmente e diventa un radicale, perchè possiede un elettrone spaiato. Questo radicale (HO₂•) viene detto radicale Idroperossile, ed è estremamente reattivo; normalmente questo radicale ha un’emivita molto breve e dissocia velocemente, formando un altro radicale, l’anione superossido: O₂^-•. Tutti questi radicali si diffondono molto velocemente nella cellula, reagendo con tutto quello che incontrano e propagandosi. Se contemporaneamente all’anione superossido, si viene a formare Perossido di Idrogeno a partire dal radicale idroperossile (HO₂• + 1e^- + 1H⁺ -> H₂O₂), si ha la cosiddetta reazione di Haber-Weiss e la formazione di un altro dannoso radicale dell’ossigeno, il radicale Idrossile:

H₂O₂ + O₂^-• -> OH^- + OH• + O₂

Abbiamo visto quindi che a causa di reazioni di ossido-riduzione si possono ottenere diverse specie reattive dell’ossigeno, alcune con carica altre neutre, tutte estremamente instabili e reattive. Quelle più pericolose sono quelle senza carica perchè essendo apolari possono attraversare le membrane fosfolipidiche e diffondersi. Ma quali sono i danni che possono arrecare ad una cellula? I più comuni problemi sono dati dall’attacco del DNA. Questi radicali dell’ossigeno sono in grado di reagire con le basi azotate e ossidarle, inducendo mutazioni. Possono anche indurre la rottura dei filamenti del DNA causando danni maggiori. I radicali liberi possono anche attaccare le proteine e alterarne la struttura, ad esempio tutte le proteine che hanno dei residui di cisteina (che hanno quindi dei gruppi sulfidrilici -SH) possono subire l’ossidazione e formare un legame tra due gruppi SH (S-S) e viceversa. Ma forse il danno più grave è quello alle membrane. Le membrane cellulari sono costituite da un doppio strato fosfolipidico; Un fosfolipide è una molecola costituita da una parte polare (carica elettricamente, di solito un gruppo fosfato più un fruppo funzionale come la colina, l’etanolammina ecc..) e da due lunghe catene di acidi grassi; Un acido grasso è una catena idrocarburiche totalmente apolari (tranne che per il carbonio 1 che, portando il gruppo chimico acido, COOH, è polare). Una catena idrocarburica è costituita dalla ripetizione N volte del gruppo -CH₂-. In una membrana i due strati fosfolipidici sono giustapposti proiettando verso l’interno le catene apolari e verso l’esterno le teste polari (fosfato & Co.), solo in questo modo le membrane possono interagire con un ambiente in prevalenza acquoso (ricordo che una molecola apolare non si scioglie in acqua, come ad esempio l’olio nel brodo che forma delle chiazze galleggianti). Le nostre membrane cellulari sono fondamentali perchè conferiscono integrità alle cellule e le mantengono separate. Inoltre sono responsabili degli scambi di molecole con l’ambiente esterno. Molte catene degli acidi grassi possiedono delle insaturazioni, ovvero dei doppi legami; un doppio legame si forma in seguito ad una ossidazione della catena:

-CH₂-CH₂-CH₂-CH₂-CH_2- -> -CH=CH-CH₂-CH=CH-

Questa catena idrocarburica ha subito due insaturazioni: al C1 e al C4, diventando così poli-insatura. Molte catene idrocarburiche nelle nostre membrane sono poli-insature (gli acidi grassi poli-insaturi che i nutrizionisti chiamano omega-3, omega-6 e omega-9). Se le nostre membrane vengono attaccate da specie radicaliche come il radicale idrossile (OH•), questi radicali vengono “spenti” proprio dai nostri acidi grassi poli-insaturi che subiscono però delle perossidazioni (Aggiunta di OOH ad un carbonio).

LH + OH• + O₂ -> LOO• + H₂O

Dove L è un lipide generico che viene radicalizzato da un OH•, che si riduce ad acqua, in LOO•; Questa forma è instabile perchè è essa stessa un radicale per cui è in grado di attaccare altri lipidi di membrana e di propagarsi allo stesso modo, ma è anche in grado di spegnersi (LOO• + LOO• -> LOO-OOL). Quindi le membrane possono tamponare uno stress ossidativo, e per questo sono utili, ma se quest’ultimo dovesse essere troppo grande gli acidi grassi perossidati LOOH diventerebbero molti; una molecola che si lega all’ossigeno diventa polare, la polarizzazione degli acidi grassi delle membrane (che dovrebbero essere apolari) attira molecole di acqua (polare anch’essa), e l’entrata dell’acqua all’interno del doppio strato fosfolipidico porta al suo scompaginamento, la membrana si dissolve (si solubilizza) e questo porta alla perdita dell’integrità cellulare, quindi alla morte della stessa (fenomeno noto come perossidazione lipidica e solvatazione delle membrane).
In condizioni normali, la generazione di radicali è perfettamente contenuta, ma in particolari situazioni patologiche o ambientali (esposizione a agenti tossici come il tetracloruro di carbonio, fumo di sigaretta e farmaci come il paracetamolo, o radiazioni ionizzanti) si può generare uno stress ossidativo molto forte che può causare la morte di molte cellule (necrosi tissutale).
Il nostro organismo ha svliuppato molte difese nei confronti dei radicali, quindi normalmente li teniamo sotto controllo e non permettiamo che causino danni. Esistono difese enzimatiche (enzimi in grado di spegnere la propagazione dei radicali) e difese non enzimatiche, molecole che vengono ossidate/ridotte dai radicali che in questo modo si spengono, prima fra tutte la vitamina C. Spero di non essere stato troppo prolisso e spero vi abbia interessato. Ho voluto sottolineare come la formazione di ROS sia quasi “fisiologica” in un metabolismo ossidativo come il nostro e che normalmente riusciamo ad annullarne gli effetti tossici, ma ho sottolineato che come a volte capiti che le nostre difese non bastino e in questo caso i danni possono essere gravi. Alla prossima

Se non l’avessi ripetuto praticamente in ogni articolo che ho scritto, magari vi farebbe più effetto, ma non sto esagerando quando vi dico che ciò di cui voglio parlarvi è della massima importanza. Tutti i sistemi viventi hanno bisogno di energia. Questa energia è necessaria per mantenere il sistema vivente lontano dall’equilibrio con l’ambiente circostante. Quando un organismo muore, smette di ricavare (non dal nulla ma per conversione) energia utile, e questo col tempo lo porta a “disorganizzarsi” e a tornare in equilibrio con l’ambiente circostante, in un certo senso torna alla natura. Dove è possibile individuare questa organizzazione superiore negli organismi viventi? Ma ovunque! La più piccola e semplice cellula del più antico batterio ha un livello di organizzazione straordinario! innanzitutto è separato dall’ambiente esterno da una membrana fosfolipidica a sua volta ricoperta da una parete cellulare rigida, questa parete serve a proteggerlo, a mantenere insieme tutte le componenti interne (DNA, RNA, proteine ecc..) e a mediare gli scambi con l’esterno! Mantenersi “divisi” dall’ambiente esterno è fondamentale. Poi prendiamo le proteine. Le proteine sono costituite dall’unione di amminoacidi, che ne sono venti in tutto. Per sintetizzare una proteina innanzitutto è necessario avere l’informazione per farlo (proveniente dal DNA), quindi è necessario avere l’occorrente: amminoacidi, energia, e un sistema di sintesi. da un insieme disordinato di amminoacidi singoli, otteniamo un prodotto finale estremamente più complesso, e questa sua complessità va molto al di là della semplice somma della funzione dei singoli amminoacidi, e dipende soprattutto dalla struttura e dalla conformazione della proteina: interferire con la struttura significa annullare la funzione della proteina e ridurla ad una semplice successione di amminoacidi.
Come ottenere l’energia adatta? Innanzitutto, come dice la prima legge della termodinamica, l’energia non può essere creata nè distrutta ma soltanto convertita. Ed è proprio quello che fanno i sistemi viventi. Per ottenere l’energia i sistemi viventi necessitano di molecole di cui possono “utilizzare” i legami chimici.
Il modo più comune per ricavare energia da una molecola è ossidarla. Cosa significa ossidare lo vedremo subito.
Dal punto di vista biologico (e non solo) molto importanti sono le reazioni di ossido-riduzione. Una specie chimica che si ossida è una specie chimica che “perde” elettroni mentre quella che li riceve si riduce. Ovviamente se una specie si ossida ce ne deve essere un’altra che alla fine si riduce, in questo modo il numero di elettroni (o equivalenti riducenti) rimane invariato nella reazione. Ma facciamo alcuni esempi di come le specie chimiche possono ossidarsi e ridursi:
la formazione della ruggine è il più classico esempio di reazione di ossido-riduzione, la cui reazione è la seguente:

3Fe + 4H₂O -> Fe₃O₄ + 4H₂

Il ferro, il cui numero di ossidazione a sinsitra della reazione è 0 (essendo sottoforma di ferro elementare privo di carica non ha elettroni nè in eccesso nè in difetto) a destra della reazione è +4 (sono stati persi quattro elettroni) mentre l’ossigeno li ha acquistati, ma visto che l’ossido di ferro (III) è una specie chimica nuova, l’ossigeno non ha propriamente sottratto gli elettroni al ferro, perchè comunque contribuiscono a formare il legame. Abbiamo quindi visto quindi che per ossidarsi una specie chimica può legarsi all’ossigeno (d’altronde ossidare deriva da ossigeno).
Una specie chimica però può perdere definitivamente gli elettroni a favore di un’altra:

Fe²⁺ + Cu²⁺ -> Fe³⁺ + Cu⁺

Infine, possiamo ossidare una specie chimica sottraendo atomi di idrogeno. Gli atomi di idrogeno sono costituiti da un protone ed un elettrone. Sottraendo entrambi, non si determina la formazione di una carica netta (specie ionica), ma la specie chimica ha perso a tutti gli effetti un elettrone. Solitamente gli atomi di idrogeno vengono tolti sempre in coppia, come nell’esempio:

CH₃-CH₂-CH₂-CH₃ -> CH₃-CH=CH-CH₃

Il butano ha quindi dubito una deidrogenazione del carbonio 2 e del carbonio 3 che trobandosi ciascuno un elettrone libero l’hanno successivamente impegnato in un doppio legame (formando così il 2-butene). E’ stata introdotta un’insaturazione.
Come dicevo nei sistemi biologici le reazioni di ossidoriduzione sono centrali nel metabolismo. Per ottenere energia vengono ossidate le molecole (come zuccheri, acidi grassi), ad esempio una molecola di glucosio, uno zucchero a sei atomi di carbonio estremamente importante perchè è una delle poche fonti di energia di molti tessuti come il cervello (che non è in grado di metabolizzare grassi), viene incanalato in una via metabolica chiamata glicolisi. La glicolisi (la via centrale del metabolismo degli zuccheri) prende una molecola di glucosio e ne ottiene due di acido piruvico (piruvato) secondo la seguente reazione:

C₆H₁₂O₆ -> 2X C₃H₄O₃

Noterete subito che l’unica cosa ad essere cambiata è il numero degli idrogeni che passano da 12 a 8. Ben quattro atomi di idrogeno sono stati prelevati dal glucosio (che si è ossidato a piruvato) e sono stati trasferiti. L’accettore di questi atomi di idrogeno (quindi 4 elettroni) è una molecola organica estremamente importante, il NAD (Nicotinammide-Adenin-Dinucleotide). Il NAD è una molecola non proteica che si associa transientemente agli enzimi che operano le reazioni di ossidoriduzione (si dice che è un cofattore) che si chiamano ossidoreduttasi o più comunemente deidrogenasi. Le deidrogenasi sono in grado di sottrarre elettroni ad una specie chimica trasferendoli su questa molecola che da ossidata (NAD⁺) si riduce (NADH), ma sono anche in grado di ridurre con il procedimento opposto. Quindi è il NAD a ridursi, a prendere gli elettroni sottratti al glucosio. Una molecola di NAD è in grado di ridursi a NADH accettando su di sè 2 elettroni ed un protone (ione idruro) liberando nell’ambiente circostante il protone rimanente. Per cui la reazione prima scritta diventa:

C₆H₁₂O₆ + 2NAD⁺ -> 2X C₃H₄O₃ + 2NADH + 2H⁺

L’enzima della glicolisi responsabile dell’ossidazione del glucosio è la Gliceraldeide-3fosfato Deidrogenasi , per gli amici GAPDH. Le deidrogenasi che funzionano con il NAD⁺/NADH sono dette deidrogenasi piridiniche, ma il NAD non è l’unico cofattore a potersi ridurre/ossidare, esistono anche cofattori cosiddetti flavinici (con le conseguenti deidrogenasi flaviniche) che sono FMN e FAD . Due considerazioni. La prima: la glicolisi è una via che da sola è in grado di produrre energia, sottoforma di ATP (le cellule immagazinano l’energia in legami chimici ad alta energia, come il legame tra i gruppi fosfato dell’ATP). Da una singola molecola di glucosio la glicolisi ricava 2 molecole di ATP (in realtà 4, ma se ne spendono due all’inizio pertanto il bilancio è 2). Questo ATP, questa energia ottenuta dal glucosio, non è però ottenuta grazie agli elettroni sottratti, ma attraverso un processo nominato “fosforilazione dell’ADP ad ATP a livello del substrato”, che in parole povere significa che il legame altamente energetico dell’ATP (ADP + P -> ATP) viene sintetizzato rompendone un altro a maggior contenuto energetico. Questi legami a maggior contenuto energetico di quello dell’ATP sono rispettivamente quello dell’acido 1-3 bifosfoglicerico e dell’acido fosfoenolpiruvico, entrambi intermedi della glicolisi e dai quali, appunto viene sintetizzato ATP (l’ATP non è quindi la molecola a più alto contenuto energetico, ma si trova esattamente a metà). La seconda considerazione è che se i NADH ottenuti non si riossidassero alla fine della glicolisi, si arriverebbe ad un punto che non si avrebbe nessun NAD ossidato, e questo come potete capire interromperebbe la glicolisi stessa. Per cui il NADH deve essere periodicamente riossidato per potere tornare utile alla glicolisi. Come si riossida? Se non è presente ossigeno, e siamo quindi in condizioni di anareobiosi, come ad esempio nel muscolo sottosforzo (ad esempio in un atleta durante una maratona), il NADH viene riossidato sul piruvato stesso, che viene ridotto ad acido lattico dall’enzima lattico deidrogenasi. L’acido lattico è un componente tossico perchè abbassa il pH per cui il muscolo non può lavorare a lungo senza ossigeno:

2X C₃H₄O₃ + 2NADH + 2H⁺ -> 2X C₃H₆O₃ + 2NAD⁺

In virtù del fatto che non si spreca mai niente, dopo lo sforzo eseguito, l’acido lattico viene portato al fegato dove viene trasformato in glucosio attraverso un processo di gluconeogenesi, e come potrete capire in questo caso serviranno equivalenti riducenti!
Se invece è presente ossigeno, come nella maggioranza dei tessuti in condizioni normali, allora il discorso si complica, perchè a questo punto non ci si ferma più solo alla glicolisi, ma si entra in un famoso processo chiamato “Respirazione Cellulare”. Nella respirazione cellulare ci sono tre fasi. La prima fase, indipendentemente da che molecola si parte (zuccheri, grassi, proteine) porta alla formazione di una molecola molto importante: l’acetil coenzima A: una molecola a due atomi di carbonio (acetile) coniugata ad un cofattore molto importante il coenzima A, Il coenzima A come potete vedere ha un gruppo SH (zolfo-idrogeno, chiamato gruppo tiolico), ed è proprio a questo gruppo SH che si coniuga l’acetile. Ora, noi nella glicolisi siamo arrivati al piruvato. Il piruvato rappresenta un bivio, se non c’è ossigeno viene ridotto ad acido lattico, se c’è ossigeno allora entra nel mitocondrio e viene ossidato ad acetile (perde quindi un atomo di carbonio sottoforma di CO2) e viene coniugato al coenzima A (Il tutto grazie ad un complesso multienzimatico chiamato Piruvato Deidrogenasi). L’acetil Coenzima A a questo punto entra nella seconda fase, sempre nel mitocondrio, il cosiddetto ciclo di Krebs, noto come Ciclo dell’Acido citrico o Ciclo degli acidi tricarbossilici. In questa via metabolica ossidativa, l’acetile viene ulteriormente ossidato a 2 molecole di CO2, con la produzione di 3NADH e 1 FADH₂.
Partendo quindi da una molecola di glucosio (C₆H₁₂O₆) otteniamo 2 molecole di piruvato (C₃H₄O₃).Dal piruvato otteniamo 2 molecole di Acetil Coenzima A (un acetile è C₂H₄O₂) perdendo in questo passaggio 2 molecole di C02. I due acetil Coenzima A vengono ulteriormente ossidati a 4CO2. Vengono ridotti 8NADH (2 nella glicolisi e 3 per ciascuno dei due acetil coenzima A) e 2FADH2.

La grande resa energetica di queste vie metaboliche è ottenuta proprio grazie agli elettroni sottratti al glucosio (in questo caso) e conservati nei cofattori ridotti NADH e FADH₂. Questi elettroni sono i responsabili della sintesi di grandi quantità di ATP. Il problema è dove metterli? Che cosa si può ridurre con questi elettroni? Ma l’ossigeno naturalmente. L’ossigeno è l’accettore finale di tutti gli elettroni sottratti alle molecole ossidate per produrre energia. L’ossigeno si trova sottoforma di molecola biatomica O₂. I cofattori ridotti vengono a loro volta ossidati da delle proteine presenti nei mitocondri (dove avviene sia il ciclo di Krebs che la riduzione dell’ossigeno, che la sintesi di ATP). Queste proteine formano una specie di catena, attraverso cui gli elettroni passano ordinatamente, per arrivare all’ossigeno. Durante il passaggio degli elettroni da una proteina all’altra, viene liberata dell’energia (eV) che viene utilizzata per creare un gradiente chimico di protoni (H+) tra un lato e l’altro della membrana mitocondriale (le proteine attraverso cui passano gli elettroni dei cofattori, sono inserite nella membrana interna del mitocondrio, e quando passano gli elettroni usano l’energia liberata da loro per creare una differenza di potenziale tra un capo e l’altro della membrana). Gli elettroni arrivano all’ossigeno riducendolo ad Acqua, e la differenza di potenziale a livello della membrana mitocondriale viene utilizzata per sintetizzare ATP a partire da ADP + P, grazie ad un enzima chiamato ATP sintasi.

O₂ + 4e- + 4H⁺ -> 2H₂O.

Vengono sintetizzati 3ATP per ogni NADH che si riossida, e 2 ATP per ogni FADH2 che si riossida. L’efficienza è del 42% circa.
L’equazione finale diventa quindi:

C₆H₁₂O₆ + 6O₂ -> 6CO₂ + 6H₂O

Abbiamo quindi visto come il flusso degli elettroni dal glucosio (o qualsiasi molecola) all’ossigeno è importantissima per produrre energia! Abbiamo anche capito perchè il ciclo di Krebs e la catena di trasporto degli elettroni si chiama respirazione cellulare, perchè consuma ossigeno e produce anidride carbonica, come durante la respirazione polmonare!
Alla prossima e mi raccomando usate i commenti! Spero vi sia piaciuto questo articolo!

Come ci finiscono delle sequenze su un vetrino? Il processo di Loading è ormai robotizzato, ed esistono due diversi metodi: gli spotted microarray in cui vengono caricate ordinatamente delle microgocce (spot) ciascuna con una concentrazione picomolare di una sequenza complementare e specifica ad un unico RNA messaggero. Ci sono anche gli in situ synthetised arrays, in cui le sequenze sono direttamente sintetizzate in situ, sul vetrino stesso. Quello che è importante capire è che in un modo o nell’altro avremo una griglia ordinata di cluster di sequenze e ciascuno di questi cluster è specifico per un unico trascritto.
Moltissime aziende biotecnologiche hanno messo sul mercato arraychip sempre più moderni e all’avanguardia e a prezzi sempre più competitivi (L’affymetrix, l’Illumina, l’Agilent technologies ecc..).
Ci sono Chips in grado di misurare l’espressione di 28000 geni per campione. Inoltre, l’affidabilità dei risultati è garantita dal fatto che ci sono più tipi di sonde per ciascun trascritto, per garantire specificità e riproducibilità dei risultati.

due ArrayChip dell'Affymetrix notate le dimensioni in confronto al fiammifero

Ok, perfetto. Io ho questi chip, che possono comodamente stare in una mano, su questi chip sono caricati con un ordine ben preciso le sonde (sequenze) specifiche per un trascritto. Ma come faccio a misurare effettivamente l’espressione genica con questi chip? In parole povere,molto povere, si fa quanto segue:
1) Prima di tutto si disegna l’esperimento. Poniamo di volere analizzare l’espressione genica di cellule tumorali prelevate da una biopsia e confrontarla con il tessuto di origine. Questo tipo di esperimento ha lo scopo di esaminare quali sono quei geni che hanno un livello di espressione diverso nelle cellule tumorali rispetto al tessuto normale. E soprattutto, un esperimento di questo tipo permette di avere una visione d’insieme di tutti i geni espressi in un dato momento.
2) Si determinano i campioni da utilizzare, la ripetibilità, i controlli positivi e negativi e i costi dell’esperimento.
3) Si ordinano i chip scelti in modo che possano dare le risposte al tipo di esperimento disegnato
4) Si preparano i campioni, in questo caso un certo numero di biopsie tumorali e un certo numero di tessuti di controllo, dai quali si estrae l’RNA messaggero totale. Una volta estratto, l’RNA deve essere testato per la sua qualità. Visto che l’RNA ha una natura instabile tende a degradarsi. Per cui assicurarsi che i campioni non siano degradati è fondamentale.
5) Il passo successivo è la retrotrascrizione, Poiché come ho detto l’RNA è instabile, i messaggeri si retro trascrivono in DNA grazie alla Trascrittasi Inversa. Il problema è che dobbiamo trascrivere tutti i messaggeri presenti, per cui non possiamo usare primers specifici per ogni trascritto per ovvie ragioni. Si sfrutta pertanto la coda di poliA che viene aggiunta dopo la sintesi dell’RNA da una poliA polimerasi cellulare. Utilizzando un primer di poliT si retrotrascrive il filamento di DNA complementare. Quindi si ottiene un ibrido DNA/RNA. l’RNA viene digerito da una RNAasi, e si ottiene un singolo filamento di DNA. A questo punto, per sintetizzare il filamento di DNA complementare, o si usano i cosiddetti random primers, ovvero oligonucleotidi che per ragioni probabilistiche si appaieranno casualmente e quindi potranno dare inizio alla sintesi del filamento, oppure si sfrutta il fatto che il single strand DNA assume delle conformazioni particolari perchè è altamente idrofobico e quindi si ripiega su se stesso stabilizzandosi; in questo modo si sfrutta questo ripiegamento come se fosse un primer e si sintetizza il secondo filamento. Un passaggio fondamentale è quello di marcare, durante la retro-trascrizione, le sequenze di DNA con dei marcatori fluorescenti; in particolare si marcano le sequenze dei campioni tumorali con un fluoroforo (ad esempio la Cianina 5, Cy5 che a dispetto del nome ha un picco di emissione nel rosso, 670nm) e le sequenze retrotrascritte dai campioni di cellule sane con un fluoroforo diverso (ad es la Cy3 che ha un picco di emissione nel verde 570nm). La marcatura delle sequenze può essere diretta o enzimatica.
6)A questo punto, per ogni chip di microarray si mescolano un campione tumorale ed uno normale (ricordo che sono marcati in modo diverso) e si depositano micro-aliquote di questo mix per ogni spot sul vetrino di microarray (è tutto robotizzato). In questo modo le sequenze di DNA marcate dei campioni da analizzare si ibridano in modo proporzionale alla loro concentrazione alle sonde specifiche fissate sul microarray. In questo modo solo le sequenze che in modo specificano si legano alle sonde rimangono, quelle che invece non sono specifiche vengono successivamente “lavate via”. Questo avviene in ogni spot del microarray, laddove una sequenza marcata trovi una sua sequenza complementare e specifica.
7)La piastra di microarray, dopo che è avvenuta l’ibridazione, viene letta ad uno scanner con due laser (ad esempio un laser ad Argon e uno all’Elio/Neon che eccitano i fluorofori a particolari lunghezze d’onda, e questi in risposta emettono fotoni che vengono rilevati da un sensore. Viene quindi rilevata la fluorescenza delle sequenze marcate ibridate alle sonde. Gli spot in cui soltanto le sequenze tumorali si sono ibridate alle sonde fissate daranno un segnale rosso. Questo vuol dire che il gene del messaggero in questione era espresso solo nelle cellule tumorali e non nelle cellule normali. Se lo spot invece dà un segnale verde, allora vuol dire che quel messaggero era espresso solo nelle cellule normali. Se lo spot non dà nessun segnale, ovviamente il gene non era espresso in nessuno dei due campioni, ma i casi più frequenti sono le situazioni intermedie in cui abbiamo entrambi i segnali, stabilire l’intensità di questi segnali permette di capire quale dei due è più forte. Poiché la misurazione è influenzata anche dalla quantità di marcatori fluorescenti incorporata nelle sequenze da ibridare, è opportuno quantificare questo parametro.
Ovviamente tutti questi segnali vengono letti ed analizzati da software specifici e quello che noi otteniamo è una visione di insieme delle differenze di espressione genica di due campioni.

Ecco come appare un ArrayChip all'analisi fluorescente. Ciascun puntino corrisponde ad un Gene

Quello che otteniamo quindi non è il valore assoluto, ma la quantità relativa dei messaggeri. Con la PCR quantitativa noi avevamo una quantificazione assoluta del messaggero, qui abbiamo una quantificazione relativa. Con una PCR quantitativa posso quantificare i messaggeri di poche decine di geni, con un microarray di ultima generazione posso quantificare relativamente l’espressione di tutti o quasi i geni di un organismo. In molti casi, per validare i risultati ottenuti con i microarray viene eseguita la PCR quantitativa sui geni che si ritengono essere più importanti. Con l’idea che se vedo la stessa cosa con due metodiche diverse, allora probabilmente sto vedendo una fenomeno reale.
Con i Microarray bisogna fare molta attenzione, innanzitutto si assume che l’efficienza di ogni passaggio del protocollo (dall’estrazione all’ibridazione) sia identica per ogni trascritto, e questo non possiamo dimostrarlo. Ripetere l’esperimento aiuta a eliminare gli errori casuali, ma non quelli sistematici, se ad esempio la retrotrascrizione di un messaggero non è efficiente, questo non si può modificare. Inoltre assumiamo che la quantità di messaggero sia direttamente proporzionale alla quantità di proteina, e questo non è sempre vero. Inoltre se anche vedessimo che un determinato gene è espresso dieci volte in più nel tumore rispetto al tessuto normale, non sarebbe comunque una prova definitiva che quel gene è implicato nella tumori genesi.
Contraddico ora ciò che ho detto poco fa. Il semplice rapporto tra l’intensità dei marcatori fluorescenti non è utilizzabile come misura della differenza di espressione di un gene in due campioni. Esiste un rumore di fondo, un background, che inizialmente era aggirato con l’utilizzo di cut-off. per cui, ad esempio, un gene si considerava differenzialmente espresso se il rapporto superava il 2 o scendeva sotto lo 0.5, ma questi sono cut off arbitrari e possono falsare i risultati. Molto spesso, si eseguono dei replicati, ovvero sullo stesso microarray un gene è rappresentato da più spot, sparsi casualmente sulla piastra, in modo da lavorare su delle medie e non su singoli valori. Ovviamente poi bisognerà eseguire dei test di ipotesi. L’analisi statistica dei risultati di un esperimento di Microarray e tutto tranne che banale. A seconda dei test che si usano possono venire risultati diversi. Quindi è molto difficile standardizzare e confrontare esperimenti eseguiti in laboratori diversi.
Resta comunque il fatto che i Microarray hanno dato un contributo fondamentale allo studio dell’espressione genica e hanno permesso di fare grandi passi avanti. I Microarray sono utilizzati per moltissime applicazioni, non solo per l’espressione genica. Ad esempio esistono gli SNPs Microarray, che servono per sondare la variabilità genetica interindividuale, e magari associare questa variabilità alle diverse risposte ai farmaci (Vedere l’articolo Non siamo tutti uguali. Questo articolo, sebbene smisuratamente lungo, è comunque una semplificazione notevole dell’argomento. la mia intenzione era queslla di illustrare nei principi generali la tecnica senza scendere troppo nei dettagli. Ecco comunque alcuni Link Utili, che rappresentano anche i siti da cui ho preso alcune delle informazioni per scrivere questo articolo

Una pagina curata dall’Università dello Utah

Link a cura della massima autoirità della bioinformatica, l’NCBI

Link sull’analisi dei dati di un esperimento di Array

Se avete domande o dubbi o se notate errori fatemelo notare senza problemi nei commenti. Provvederò a correggermi immediatamente. Grazie della pazienza, alla prossima.

Questo post è inserito nel contesto de Il Carnevale della Biodiversità che è ormai giunto alla terza edizione, con il grande entusiasmo dei blogger che vi partecipano.  L’argomento di questa terza edizione è Le dimensioni contano e la nostra interpretazione ha rappresentato cercare dove le dimensioni non contano, ovvero cosa rimane costante nella varietà della vita. Gli altri blog partecipanti hanno fornito altri contributi molto molto interessanti i cui riferimenti possono essere trovati qui.

Physicists tend to look for universals and invariants whereas biologists often get preoccupied with all the variantsions in nature.

-  Jim Brown,  biologo dell’Università nel Nuovo Messico

Solo con la parola meraviglia si può descrivere ciò che si prova di fronte alla varietà delle forme di vita che conosciamo, alle sue mille sfaccettature, alle forme e alle dimensioni che spaziano dai ricci di mare, alle sequoie, agli insetti e alle diatomee. Ulteriore meraviglia deriva dalla scoperta che tutti questi organismi così diversi hanno relazioni molto più strette di quanto un primo impatto possa suggerire.

In particolare, in questo post tratteremo il risultato di una collaborazione per certi aspetti curiosa tra due biologi , Jim Brown e Brian Enquist, ed un fisico, Geoffrey West, i quali alla fine degli anni ’90 hanno cercato di spiegare come diverse  caratteristiche degli organismi viventi come il numero di battiti cardiaci, le dimensioni del cervello e dei muscoli, etc  cambino al variare delle dimensioni degli organismi stessi.

Il risultato, per certi aspetti tutt’ora controverso, è una delle poche leggi della biologia, che di fronte alla complessità e alla varietà degli organismi studiati,  suggerisce una sorta di regola generale e piuttosto semplice.  Il modo migliore per arrivare a questo tipo di leggi di scala consiste nel concentrarsi su qualche esempio.

Tutti sappiamo che tendenzialmente gli animali più grandi sono dotati di un cervello di dimensioni maggiori. E’ interessante però anche chiedersi come cambino le masse medie del cervello per animali di diversa massa e vedere se esiste qualche proporzione. Il risultato di quest’analisi è il grafico riportato.

In questo grafico a dispersione con assi logaritmici sono riportate in ascissa le masse degli animali rappresentati e in ordinata quelle dei loro cervelli

Per comodità in questo tipo di studi si utilizzano quasi sempre grafici in scala logaritmica per diversi motivi. Anzitutto occorre osservare che se mantenessimo una scala lineare il grafico non sarebbe così immediato da capire perchè i punti sarebbero molto più dispersi. Inoltre siccome ad ogni “tacca” corrisponde una moltiplicazione per 10 la scala logaritmica risulta funzionale per fare confronti tra diversi animali. Infine, se utilizzassimo la scala lineare il risultato sarebbe una curva che è tendenzialmente di più difficile interpretazione. In questi esempi utilizzando la scala logaritmica otteniamo quasi sempre dei dati che possono essere interpolati con una retta i cui parametri sono molto più semplici da studiare.  Anzi, in realtà il parametro da studiare è soltanto uno: il coefficiente angolare della retta in questione. I casi che possiamo ipotizzare sono diversi:

1) possiamo pensare che la pendenza della retta sia 1. Ciò significa che se le dimensioni (in questo caso la massa) dell’organismo raddoppiano anche le dimensioni del cervello raddoppieranno.

2) in alternativa potremmo pensare che il rapporto sia di 2/3. Il motivo è sottile. Il ragionamento è di natura dimensionale: qualsiasi sia la forma dell’organismo in questione facendo variare le sue dimensioni, la sua massa, proporzionale al suo volume varierà con la terza potenza. Le dimensioni del cervello invece si potrebbe pensare che siano proporzionali alla superficie dell’organismo in questione (perchè con l’aumentare della superficie aumentano ad esempio le cellule sensibili all’interazione con l’esterno, ovvero quelle che inviano segnali da elaborare al cervello). Per tale motivo si potrebbe pensare che, aumentando con la terza potenza delle dimensioni la massa dell’organismo e con la seconda quella del cervello il coefficiente angolare della retta sia 2/3.

Questo tipo di ragionamento può essere fatto non solo per le dimensioni di qualsiasi organo, ma anche per altre grandezze, come il numero di battiti cardiaci, la durata della vita, etc… Ciò che è interessante è che per la stragrande maggior parte di questi esempi, cervello compreso, il legame con la pendenza è sempre lo stesso. Nel nostro esempio la pendenza non si rivela infatti essere 1 e nemmeno 2/3 , bensì un numero compreso tra i due pari a 3/4.

Questo numero compare anche in altri tipi di studio, in particolare è oggett della cosiddetta legge di Kleiber che mette in relazione la massa di un organismo con l’inverso del suo rate metabolico (utilizzando come sempre la scala logaritmica). Ovviamente questo tipo di legge contiene al suo interno piccole variazioni, ad esempio tra organismi a sangue caldo, organismi a sangue freddo e unicellulari, ma pur con queste piccole differenze si applica a tutti gli animali e ai batteri (e con opportune modifiche anche ai vegetali).

In questo grafico si può vedere, in scala logaritmica, la relazione tra dimensioni di un organismo e il suo tasso metabolico.

Il motivo per cui la pendenza di queste rette è di 3/4 è rimasto piuttosto oscuro fino agli studi di West, Brown ed Enquist, che hanno derivato matematicamente questo risultato.  Il loro studio prende in esame il problema fondamentale  di ogni organismo, ovvero il rifornimento di ossigeno e nutrienti. Diversi organismi lo affrontano in modo differente: un organismo unicellulare (o semplicemente molto piccolo)  non ha grosse difficoltà perchè la maggior parte delle sue cellule è a “contatto con l’esterno” e ciò è legato a un rapporto molto alto tra superficie e volume.  Per un organismo più grande il problema del trasporto è più pressante perchè la maggior parte delle cellule che necessitano di nutrimento e ossigeno si trovano lontano dalle superfici in cui avviene lo scambio.  I risultati dopo millenni di evoluzioni sono diversi:  da dei veri e propri tubi utilizzati dagli insetti al nostro sistema circolatorio, passando per le branchie dei pesci.

Il fatto che il tasso metabolico e le dimensioni di un organismo siano legati da una potenza 3/4 può essere visto da un certo punto di vista come un compromesso tra una relazione lineare (pendenza della retta 1) e la relazione superficie-volume (pendenza 2/3). Questo compromesso è dettato da due caratteristiche principali del problema “dei rifornimenti”.

Per capire il primo immaginiamo di voler “ingrandire” un piccolo mammifero: aumentando le sue dimensioni, aumenteremo il suo numero di cellule, perciò dovremo rendere più efficiente il suo sistema circolatorio. Per fare ciò dovremo, fra il resto, aumentare la superficie dei suoi vasi sanguigni, perciò ci saranno delle cellule in più che oltre ad aumentare questa superficie aumenteranno anche il volume dell’organismo in sè! Quindi una parte del volume della crescita è occupato dal sistema di rifornimento di quelle cellule che hanno determinato l’aumento. In altre parole, se raddoppiamo il numero di cellule che hanno bisogno di essere nutrite e ossigenate il volume di quella che potremmo chiamare rete di distribuzione aumenterà più del doppio perchè serviranno più collegamenti e quei collegamenti occupano un certo volume.

La rete di distribuzione di ossigeno in un gran numero di organismi pluricellulari

L’altra ipotesi che gioca un ruolo importante nel compromesso tra linearità e rapporto superficie-volume  consiste nel considerare che il metodo più efficiente di trasporto (quello associato con meno sprechi) è quello che occupa una frazione fissa del volume totale dell’organismo.  Quest’ipotesi deriva principalmente da osservazioni empiriche: nel caso dei mammiferi  questa frazione è del 6-7%.

Mettere insieme queste due ipotesi dal punto di vista matematico non è semplice, ma partendo da questi due punti (successivamente altri ricercatori hanno utilizzato ipotesi meno restrittive) si può dimostrare che il rapporto di massima efficienza è pari a 3/4 ed è ciò che effettivamente si osserva.

La potenza di questa legge penso che sia evidente: è una legge che vale per organismi molto diversi tra loro ed è nella sua essenza incredibilmente semplice. Nonostante ci siano tutt’ora alcuni critici, questa derivazione è accettata dalla maggior parte degli ecologi e continua ad affascinare per la sua eleganza e generalità.

Per approfondire:

Methabolic Theory of Ecology on Wikipedia. Dalla legge di Kleiber si è sviluppata un’intera branca dell’ecologia.

Power Laws in Biology un articolo interessante sulle leggi di potenza in biologia, descrive molti dettagli da cui si può capire l’importanza di utilizzare la scala logaritmica in questo ambito

Of Mice and Elephants: A Matter of Scale, George Johnson, un’interessante e appassionante introduzione al lavoro di West, Brown ed Enquist

The Ancestor’s Tale, Richard Dawkins, ai temi delle leggi di scala in biologia e alla legge di Kleiber Dawkins dedica ben due racconti (Il racconto dell’homo abilis e del cavolfiore)

Dimensioni e vita, McMahon- Bonner, Una bella raccolta di esempi e problemi che riguardano dimensioni e biologia, non troppo appassionante da leggere, ma molto interessante.

]]> http://www.bottigliedileida.net/2011/04/le-dimensioni-contano-ma-la-scala-di-piu/feed/ 2 http://www.bottigliedileida.net/2011/04/the-hallmarks-of-cancer/ http://www.bottigliedileida.net/2011/04/the-hallmarks-of-cancer/#comments Sun, 03 Apr 2011 14:27:36 +0000 Manuel http://www.bottigliedileida.net/?p=1152 Nel lontano anno 2000 uscì su Cell, una importante rivista scientifica nell’ambito della biologia cellulare e molecolare, una review di due ricercatori statunitensi, Douglas Hanahan e Robert Weinberg, intitolata “The hallmarks of Cancer”. Hallmark, in italiano, è traducibile con caratteristica, proprietà. Qualche settimana fa, è uscito dagli stessi autori sulla stessa rivista la seconda puntata: “The hallmarks of cancer: The next generation”. Non vi stupite che siano passati dieci anni tra la prima e la seconda pubblicazione. Dieci anni è un tempo minimo perchè si possano tirare le somme degli esperimenti fatti fino a quel momento.
Questi due articoli segnano, diciamo, una sorta di punto di arrivo della ricerca svolta per più di trent’anni nell’ambito del cancro.
Nel primo articolo i due autori, mettendo assieme tutti i dati ottenuti, sono passati in rassegna a quelle che appunto loro definicono The hallmarks of cancer, le caratteristiche principali che la stragrande maggioranza dei tumori acquisice per potersi sviluppare. Ed è appunto proprio di queste caratteristiche che ci andremo ad occupare, e vedremo come una grandissima quantità di fenotipi tumorali che a prima vista sembrerebbero scorrelati e disordinati, in realtà rientrano in almeno una di queste caratteristiche.
I tumori sono malattie genetiche delle cellule somatiche. Partiamo da questo fatto. Si sottolinea che è delle cellule somatiche perchè la maggiorparte delle neoplasie è sporadica, ovvero non ereditata. Che poi anche qui bisogna precisare. Anche nei casi in cui è dimostrabile una familiarità di alcuni tipi di tumori (tumori, cioè, in cui l’incidenza in un gruppo di consanguinei è più alta che nella popolazione generale), ad essere ereditata non è la neoplasia, ma la predisposizione ad essa. Che è ben diverso. Uno eredita l’anemia, la fibrosi cistica, non eredita un tumore. Sperando che quanto detto fino ad ora sia chiaro, possiamo capire come le caratteristiche di un tumore siano uniche nel loro genere. Non troveremo mai un tumore identico ad un altro, anche se molto simile. Tuttavia si può dire che ciascun tumore, per essere tale deve possere una serie di caratteristiche che possonono essere dette universali. Nella prima versione, quella del 2000, le caratteristiche in questione erano sei.
Un tumore, per essere tale, deve avere una autosufficienza nella proliferazione cellulare. Le cellule tumorali, cioè, non hanno bisogno di stimoli esterni per proliferare. Normalmente le cellule non proliferano se non sono stimolate dai cosiddetti fattori di crescita, molecole che legandosi a dei Recettori specificiesposti sulla membrana plasmatica, li attivano. L’attivazione di questi recettori fa sì che nel nucleo della cellula, attraverso un complesso e sofisticato pattern di proteine, vengano attivati specifici geni le cui proteine fanno entrare in divisione la cellula. Quindi, in seguito ad uno stimolo esterno (fattore di crescita) la cellula risponde attraverso la divisione cellulare. Normalmente la disponibilità di questi fattori di crescita è limitata, e se anche dovesse eccedere si instaura un circuito (Feedback) negativo che blocca la cellula. Una cellula tumorale, invece, non ha bisogno di questi fattori di crescita per proliferare, non solo, è anche insensibile ai segnali antiproliferativi. Così come ci sono i fattori di crescita, esistono anche dei fattori che inibiscono la proliferazione. Fisiologicamente quello che cambia è il rapporto dei primi rispetto ai secondi. Una cellula tumorale è autosufficiente riguardo ai primi, non ne ha cioè bisogno, ed è insensibile ai secondi. Questo pone un bel problema. Una cellula tumorale è una cellula che l’organismo non può più controllare. Le basi molecolari di questo fenomeno sono note da tempo. Sono state infatti riscontrate moltissime mutazioni a livello dei geni dei recettori dei fattori di crescita. Queste mutazioni hanno come risultato che la proteina che formerà il recettore stesso sia in una condizione di perenne attivazione anche in assenza dei fattori di crescita. Questo fa sì che la cellula riceva costantemente segnali proliferativi, e continui così a dividersi. Oltre che al recettore, che è la componente più a monte della via di segnalazione, sono spesso mutate proteine a valle rendendo la situazione ancora più complicata. In questo caso, infatti possono essere mutate ed iperattivate proteine che inducono la proliferazione, oppure possono essere mutate proteine che inibiscono la proliferazione, ma in questo caso siamo di fronte ad una mutazione inattivante. E’ come se avessimo un’automobile, in cui o l’acceleratore è costantemente premuto oppure è rotto il sistema frenante. Meglio ancora se capitano entrambe le cose. I geni che codificano proteine che accelerano la cellula, sono chiamati Proto-Oncogeni. I geni che codificano proteine frenanti sono chiamati oncosoppressori. I primi vengono mutati ed iperattivati, o in qualche modo iperespressi, e diventano Oncogeni Attivati i secondi vengono inattivati o silenziati.
La via di segnalazione più spesso coinvolta nella proliferazione cellulare è quella di RAS-RAF-MAP KINASES, che è rappresentata da questa figura:

Cell signaling

Come potete vedere, a parte la complessità del sistema che è notevole, e che viene soltanto in parte realizzata in questa immagine, La via di segnalazione inizia in alto, da quel recettore rosso chiamato RTKs (Receptors Tyrosine Kinase). A questo recettore si lega il fattore di crescita (il triangolino) e lo attiva. Da questo recettore attraverso due proteine GRB2 e SOS, (in grigio e in arancione rispettivamente a fianco al recettore) si attiva la èproteina RAS, in violetto (le frecce indicano un’attivazione). RAS, in alternativa ai Recettori dei fattori di crescita, è trovato molto spesso mutato in cellule tumorali ed è un importantissimo oncogene, in quanto si trova a valle del recettore, e anche se il recettore è normale, RAS iperattivato risulta in una continua segnalazione proliferativa all’interno della cellula. In quanto RAS, seguendo la linea verticale attiva a sua volta RAF (oncogene anch’esso), RAF attiva MEK, che attiva ERK, che a sua volta attiva la trascrizione di numerosi geni coinvolti nella sopravvivenza e proliferazione. In questa via di segnalazione quindi, abbiamo diversi nodi che, se iperattivati, inducono la cellula a proliferare incontrollatamente.
Il terzo hallmark preso in considerazione è la capacità di evadere l’apoptosi. L’apoptosi è il meccanismo con cui una cellula, se danneggiata, privata dei fattori di crescita, o semplicemente “vecchia” muore. E’ un meccansimo regolato geneticamente ed è un evento fisiologico. I geni coinvolti in questo processo si distinguono in Proapoptotici (che sono, alla fine, degli oncosoppressori) e Antiapoptotici (che sono dei proto-oncogeni). E’ stato dimostrato che la capacità di evadere l’apoptosi è una caratteristica di probabilmente tutti i tipi tumorali.
A questo punto bisogna aprire una parentesi. Per molto tempo si è sempre pensato che sopravvivenza/proliferazione cellulare ed apoptosi fossero due processi nettamente differenziati e separati tra di loro, perchè per la nostra mente nulla ci può essere di più diverso dalla vita che la morte. Scoprire quindi che alcuni geni che tendenzialmente si credeva fossero coinvolti in un processo sono ugualmente coinvolti nell’altro ha creato scompiglio. C’è quindi una sovrapposizione molecolare tra sopravvivenza e morte cellulare. In particolare in un processo che viene definito “Oncogene-induced Apoptosis” abbiamo che se abbiamo un’iperattivazione di un proto-oncogene in Oncogene, nella maggiorparte dei casi si ha l’effetto contrario a quello che ci si aspetterebbe, ovvero la cellula, al posto di sopravvivere e/o proliferare, va in apoptosi. Questo è un meccansimo di controllo e sicurezza non da poco. Per questo i Tumori per potesi sviluppare devono contemporaneamente attivare la proliferazione e inibire l’apoptosi!
La quarta proprietà acquisita dalla maggiorparte delle cellule tumorali è l’immortalizzazione. Ho già fatto presente in diversi post che le cellule normali hanno un potenziale replicativo limitato. Ovvero dopo un certo numero di divisoni cellulari si bloccano, entrano in una fase chiamata senescenza e vanno incontro ad apoptosi. Questo è dovuto al fatto che le regioni terminali dei cromosomi, i telomeri, si accorciano di divisione in divisione, fino a raggiungere una lunghezza critica che blocca la cellula. Questo orologio biologico è molto importante, e solo le cellule staminali e quelle germinali hanno la capacità di rigenerare i telomeri e quindi replicarsi indefinitamente. Questo perchè esprimono un enzima, la Telomerasi che è in grado di allungare le estremità telomeriche. Anche una cellula tumorale deve essere in grado di replicarsi indefinitamente (almeno potenzialmente), e per questo devono esprimere il gene della telomerasi che normalmente viene espresso solo dalle cellule staminali e viene silenziato man mano che la cellula figlia si differenzia e perde la staminalità. Una cellula tumorale, quindi, può, in linea teorica, replicarsi in eterno.
Gli ultimi due Hallmarks sono in qualche modo correlati tra loro. Il quinto, infatti, riguarda la capacità di stimolare l’angiogenesi. Cos’è l’angiogenesi? Questo processo dal nome così strano è la capacità di stimolare la formazione di vasi sanguigni nuovi (capillari, per lo più) a partire da vasi pre-esistenti. Questa è una condizione sine qua non. Se le cellule tumorali (o almeno una loro sottopopolazione) non sono in grado di stimolare le cellule dei vasi sanguigni (cellule endoteliali) a proliferare e a formare nuovi vasi in direzione del tumore stesso, il tumore necessariamente regredirà. Se il tumore non riesce a farsi vascolarizzare sufficientemente, non sarà in grado di assorbire i nutrienti necessari alla proliferazione. In molti casi le cellule tumorali secernono dei Fattori pro-angiogenetici (che alla fine sono una sottoclasse dei fattori di crescita) che raggiungono i capillari circostanti e li inducono ad ulteriore sviluppo.
Infine, molti tipi di tumori, anche se non tutti, sono in grado di diffondersi attraverso i vasi sanguigni e linfatici e colonizzare altri tessuti, formando le metastasi. Le metastasi sono quindi originate da cellule del tumore primitivo che si staccano dalla massa originaria, entrano nei vasi sanguigni e colonizzano altri tessuti formando tumori secondari. Un tumore che ha già dato metastasi è ormai agli ultimi stadi, e come tale avrà una prognosi peggiore rispetto ad un tumore non diffuso.
Questi, quindi, sono i sei punti chiave che è stato dimostrato che sono comuni alla stragrande maggioranza dei tumori. Le vie attraverso le quali una cellula tumorale acquisisce queste capacità possono essere diverse, ma alla fine è il risultato quello che conta.
Nella versione aggiornata del 2011, i due autori hanno individuato altre quattro caratteristiche salienti:
-Evitare la distruzione da parte del sistema immunitario
-L’infiammazione come elemento che favorisce il tumore (a questo riguardo si potrebbe scrivere un trattato, ma ora come ora lo rimanderei)
-Marcata instabilità genomica, come ho scritto nel post precedente a questo, le cellule hanno una serie di meccanismi che riparano il DNA e lo preservano dalle mutazioni. Le mutazioni sono ciò che, alla fine, rende possibile alle cellule l’acquisizione di queste caratteristiche fino ad ora discusse. Se abbiamo una stabilità genomica ridotta, avremo un tasso più elevato di mutazioni e una probabilità maggiore di sviluppare tumori.
-Alterato metabolismo: le cellule tumorali hanno un metabolismo energetico profondamente alterato che rende loro possibile ricavare grandi quantità di energia anche in condizioni proibitive per le altre cellule.

Tutto questo, quindi, mette in evidenza come si possano comunque tracciare delle linee generali che in qualche modo mettano un po’ di ordine nel complesso mondo dell’oncologia molecolare. Spero di essere stato chiaro, e non eccessivamente noioso. Come sempre vi esorto a fare domande se ne avete o correzioni!

Alla prossima!

Oltre al crossing over, che avviene nei gameti, abbiamo la ricombinazione somatica che avviene nei linfociti. (somatica perché avviene in cellule somatiche e non germinali). Il meccanismo di base è lo stesso, cambia ovviamente il soggetto e il risultato. (tra l’altro, sempre nel post Knock out, spiego come è possibile usando la ricombinazione ottenere delle mappe cromosomiche dei geni, se vi interessa.. mi faccio anche la pubblicità).
Prendiamo come esempio il BCR. Il BCR è un recettore che appartiene alla famiglia delle Immunoglobuline, ovvero degli anticorpi. Anzi, esso stesso è un anticorpo, e la sua funzione è la stessa, ma a differenza di un anticorpo non viene liberato all’esterno, ma rimane fissato alla membrana cellulare. Quindi alla fine, gli anticorpi vengono sintetizzati a partire dagli stessi geni utilizzati per il recettore.
Per spiegare l’organizzazione dei geni del BCR, indispensabile per capire la ricombinazione somatica, faccio il percorso inverso, parto dalla proteina e arrivo al gene.
Come è fatto un BCR, e quindi un anticorpo? Sono delle proteine multimeriche, formate da più subunità proteiche, ciascuna codificata dal proprio gene. In particolare, sono costituiti da due catene proteiche pesanti, identiche tra loro associate. Ciascuna catena proteica pesante è a sua volta associata con una catena più leggera. In totale due catene pesanti, identiche, e due catene leggere, identiche. Sia le catene pesanti che quelle leggere sono divisibili in due sottoregioni, una variabile, ed una costante. L’associazione delle regioni variabili delle catene pesanti con quelle leggere formano la tasca di legame con l’antigene. Ciascun anticorpo avrà quindi due siti di legame identici per l’antigene perchè ci sono due coppie di catene pesanti e leggere. Per farvi un’idea potete dare un’occhiata a questo Link , che vi mostra, oltre alla struttura quaternaria della proteina (la prima immagine), anche uno schema più comprenibile della struttura dell’anticorpo.
Gli anticorpi possono inoltre essere di classi diverse (le classi si chiamano isotipi), ciascun isotipo si differenzia dall’altro per la porzione costante delle catene pesanti. Pertanto esistono gli anticorpi di classe A, D, E, G e M. Anche le catene leggere hanno due classi, K e λ. Tutto questo è molto mnemonico, ma necessario. Adesso arriva la parte divertente.
Esistono un gene che codifica per la catena K, uno per quella λ mentre tutte le catene pesanti sono codificate da un unico gene, o locus. Ciascuno di questi geni ha tre regioni, chiamate in ordine V, J e C. Il gene delle catene pesanti ha anche la regione D. Ciascuna regione, in ordine V, D, J e C contiene a sua volta delle sotto regioni, separate da DNA non codificante. Ad esempio il gene K leggo che ha circa 35 regioni V. Ciascun tratto V è diverso da tutti gli altri. Le regioni V(D) e J vanno a costituire la regione variabili delle catene, mentre la regione C quella costante.
La ricombinazione somatica cosa fa? Attraverso due enzimi RAG1 e RAG2 i cui geni vengono espressi solo durante la maturazione linfocitaria, vengono congiunte casualmente una regione V, una regione D ed una regione J, eliminando le sequenze interposte. Viene a crearsi una regione VDJ (o VJ per le catene leggere), che è praticamente unica nel suo genere, perché ottenuta mediante l’unione casuale dei segmenti genici V, D e J. Ci sono delle sequenze di riconoscimento per evitare che si giustappongano sequenze sbagliate. Inoltre la ricombinazione avviene soltanto su uno dei due alleli per ogni gene, in modo da evitare la sintesi di due recettori diversi. E se, ad esempio, viene ricombinato il gene λ, il gene K viene represso per evitare la sintesi di due catene leggere diverse.
Mentre per le catene leggere il discorso finisce qua, per le catene pesanti c’è ancora il discorso dell’isotipo. Il segmento genico unito VDJ viene trascritto dalla RNA polimerasi II in un RNA messaggero fino alle regioni C più prossimali. Abbiamo detto che la regione costante determina l’isotipo. Le regioni ci più prossimali sono quella M e quella D, quindi il primo isotipo che viene sintetizzato è di classe M o di classe D. entrambi gli isotipi possono venire espressi da una stessa cellula Avremo quindi una proteina formata da due catene pesanti identiche ricombinate, e da due catene leggere ricombinate anch’esse, o K o λ.
Tutti i Linfociti B, all’inizio, esprimono recettori di classe M e/o D sulla loro membrana. Quando una cellula B matura incontra per la prima volta il suo antigene specifico si attiva, e lo scopo dell’attivazione è quello di produrre anticorpi, che come ho detto, sono identici al BCR, solo che non sono inseriti nella membrana cellulare ma vengono rilasciati all’esterno. Durante l’attivazione il clone B va incontro a divisioni cellulari che porteranno alla formazione di due tipi di cellule: i cloni memoria e le plasmacellule. I primi rimangono silenti nell’organismo fino ad un successivo contatto con l’antigene, nel qual caso si riattivano e iniziano una nuova risposta immunitaria; le seconde hanno una vita limitata durante la quale producono grandi quantità di anticorpi. Durante l’attivazione è possibile che le plasmacellule vadano incontro allo scambio dell’isotipo della catena pesante, ovvero, attraverso un secondo evento di ricombinazione che porta alla congiunzione del segmento VDJ già ricombinato con un segmento C diverso da M o da D (A, E o G), eliminando tutto il segmento di DNA tra VDJ e il segmento C prescelto. Per cui, avremo una catena pesante che ha la stessa specificità per l’antigene, ma un diverso isotipo e quindi diverse proprietà. Una volta effettuato lo scambio dell’isotipo, quella plasmacellula non potrà più cambiarlo, e continuerà a sintetizzare anticorpi di quell’isotipo. Siccome le plasmacellule saranno molte, ci saranno scambi di isotipi diversi, e quindi avremo contro uno stesso antigene anticorpi con isotipi diversi.
Un discorso Analogo, anche se leggermente diverso vale per il recettore dei Linfociti T. Riassumo quindi i diversi processi che portano alla diversificazione dei BCR, e in modo analogo dei TCR:
1) Diversità combinatoria: La ricombinazione di n segmenti V, m segmenti D e x segmenti J in modo del tutto casuale.
2) Giustapposizione di un qualsiasi VDJ della catena pesante ed un qualsiasi VJ di una catena leggera
3) Non paghi di questo, durante la ricombinazione possiamo avere a livello delle giunzioni tra segmento V e il segmento D, e tra quest’ultimo e il segmento J l’aggiunta o la perdita casuale di alcuni nucleotidi. Cosicché se anche due BCR avessero lo stesso segmento VDJ non sarebbero comunque uguali.

La sintesi del BCR e del TCR è un processo centrale della maturazione linfocitaria. Se un clone non dovesse riuscire ad esprimere il suo recettore andrebbe incontro all’ Apoptosi. Inoltre, poichè le combinazioni sono casuali, possono uscire fuori delle combinazioni difettose, nel qual caso la cellula verrebbe comunque destinata all’apoptosi così come se il recettore risultasse specifico ad un antigene del self, in modo da evitare che il sistema immunitario si attivi contro l’organismo stesso (Tolleranza).

So che è stato un post lungo, difficile e magari anche noioso, ma spero di essere riuscito a trasmettere l’incredibile raffinatezza e complicatezza del processo. Se avete domande o se notate errori usate i commenti!

Alla prossima!

E’ un onore per il nostro blog partecipare alla grande iniziativa che è il Carnevale della Biodiversità. Questo post infatti compare nell’ambito del tema Infinite forme bellissime. Gli altri post dei numerosi blog che partecipano a questa interessante iniziativa possono essere trovati qui.

Preservare la biodiversità dalla sua drammatica riduzione, legata per la maggior parte all’impatto antropico, è un tema molto trattato. Tuttavia spesso ciò si verifica ponendosi nell’idea di fare ciò a scopo utilitaristico con il proposito di preservare per poi sfruttare, seppur in modo cauto e rispettoso. Quest’idea di agire a riguardo della biodiversità andrebbe cambiata poiché nulla ha di diverso rispetto a quanto avviene ora e soprattutto perché basata, sovente, su di un oramai fuori luogo concetto di antropocentrismo naturale.

di M. Affini – BottigliediLeida.net

L’emorragia di biodiversità che è in corso sul pianeta dagli ultimi 50 anni è senza dubbio un processo drammatico innescato sia direttamente che indirettamente dallo sviluppo umano. Attraverso il consumo esagerato di diversi tipi di risorse, dalle materie prime come il legname delle grandi foreste tropicali allo sfruttamento delle risorse ittiche, la grande varietà di forme vegetali e animali, sviluppatesi in migliaia, se non in alcuni casi, milioni di anni di evoluzione sta riducendosi a vista d’occhio tanto da allarmare molti ricercatori fino a diventare un tema caldo trattato spesso sia da giornali che da programmi televisi.

Alla radice del problema sta un evento molto conosciuto da chiunque abbia studiato un po’ di ecologia e/o biologia: l’ingresso di una specie esotica in un habitat a lei nuovo. In questo caso la specie esotica è la più nota: Homo sapiens.

Fin da quando almeno 500 mila anni fa questa specie si sviluppò in Africa cominciando poi, lentamente ma anche progressivamente, a invadere il resto delle terre emerse, si sono avute forti ripercussioni ecologiche legate al suo passaggio. Uno degli esempi più chiari è l’estinzione della megafauna americana.

Non so se vi è mai capitato di pensarci ma vi siete mai chiesti perché in tutte le Americhe non vi sia un singolo animale della taglia di un rinoceronte, di un elefante o d’una giraffa? Eppure le Americhe sono un continente, oppure due, qui dipende molto dai punti di vista, enorme con una grande varietà di paesaggi ed ecosistemi quindi un luogo ideale per permettere lo sviluppo di una vasta gamma di forme di vita tra cui anche animali molto grandi. Perché in Africa sì e in America no?

La causa è da ricercarsi molto probabilmente proprio nell’ingresso di una specie africana completamente nuova e vorace che, con la sua comparsa nel continente ha cambiato gli equilibri e il futuro di quella enorme massa di terra emersa: l’uomo.

Entrato nel continente americano a seguito di un lento processo di migrazione avvenuto attraverso lo stretto di Bering, estremità orientale della Siberia, durante un periodo in cui il livello dei mari era più basso di ora e quindi portava alla creazione di un ponte di terra che univa l’Asia alle Americhe, in qualche migliaio di anni si diffuse in tutto il continente arrivando sino alla Terra del Fuoco, estremità meridionale dell’america del Sud. Durante questa lunga avventura gli uomini del tempo, che avevano un bagaglio di esperienze sia nella caccia che nella raccolta maturato in migliaia di anni di pratica tra l’Africa e l’Asia, si dedicarono chiaramente a reperire cibo e risorse che in quella terra completamente nuova e inesplorata certo non mancavano. Per di più alcune di queste risorse, gli animali di taglia maggiore del periodo, animali come i mammuth, erano davvero facili da catturare visto che non erano abituati ad essere cacciati come l’uomo faceva. In pratica, in un paio di migliaia di anni la megafauna nord americana era scomparsa per sempre dalla faccia della Terra. E questo è solo il primo esempio di un processo che dura da centinaia di migliaia di anni. Si noti come l’evento si sia ripetuto in modo pressoché analogo con il bisonte americano durante l’invasione del west da parte dei coloni europei e del loro uso delle armi da fuoco.

Il problema della perdita della biodiversità è quindi collegato all’esistenza e alla diffusione del genere umano sul pianeta proprio come nel suo piccolo una specie esotica fa in un ambiente nuovo. La specie esotica introdotta in un ambiente a lei favorevole ha un periodo iniziale di boom demografico per poi decrescere a causa, ad esempio, dell’azione di parassiti cui la fauna originale era adattata. Per l’uomo ciò non è più valido a causa dell’avvento della medicina e dei vaccini. In aggiunta a ciò poi c’è un ulteriore aggravante che porta l’animale uomo ad esser così invasivo – distruttivo sulla biodiversità: la capacità di agire sull’ambiente modificandolo a suo piacimento ed in modo pressoché permanente.

Qui si entra in un discorso ancora più complesso e approfondito ma che trova alla base il punto centrale di tutta la faccenda “perdita della biodiversità”, cioé l’antropocentrismo orientato al mondo naturale in pratica l’idea che noi, essendo uomini e quindi massimo esempio di evoluzione biologica, abbiamo il diritto di poter piegare la natura al nostro volere e giudizio.

Quando si parla di perdita della biodiversità la mente vola alla deforestazione, ma è sufficiente guardare l’interno di un frigo o un allevamento di animali per vedere lo stesso fenomeno verificarsi anche se in modo meno “cruento”.

Uno dei grossi problemi che coinvolgono la relazione uomo-natura è la produzione di cibo. Mediante l’agricoltura, nata in modo indipendente in diverse parti del mondo a partire da 10 mila anni fa, l’uomo incominciò a risolvere parzialmente il problema cibo assicurandosi una piccola riserva più o meno costante di alimenti con cui integrare la propria dieta. Da questo punto molti ritengono che si possa collocare l’origine della civiltà come noi la intendiamo e sempre da qui, probabilmente ha preso il via il processo di perdita della biodiversità in modo sistematico. Agendo dapprima come un selezionatore casuale poi, via via perfezionandosi sempre più, l’uomo ha cominciato ad agire su diverse specie di organismi vegetali e animali plasmandole a sua utilità. Agendo in questo modo l’uomo ha ottenuto senza dubbio una sequenza di risultati davvero favorevoli per sé. Animali più grandi, che producevano di più, frutta e verdura sempre più grosse e nutrienti gli hanno permesso di vivere più a lungo, dotarsi di strumenti sempre migliori e commerciare con i vicini. Tutto questo però a scapito della variabilità genetica e della biodiversità secondo un processo di convergenza il cui fine ultimo era l’utilita-inutilità di un determinato carattere prima, specie dopo.

Riducendo la variabilità genetica delle specie ad uso, come possono ad esempio essere i bovini, l’uomo si è perciò comportato da fattore selettivo provocando così la perdita di un’ampia fetta di caratteri genetici e indebolendo le specie su cui andava ad agire e che ora pagano questa forte selezione trovandosi ad essere più fragili e deboli della norma. Esempio principe di questo fenomeno sono le razze canine.

In 10 mila anni di selezione nata, si pensa, a partire dal lupo, gli allevatori hanno creato un’enorme varietà di razze, di varianti della stessa specie con caratteristiche estetiche talmente diverse l’una dall’altra da lasciare abbastanza sorpresi. E’ sufficiente pensare al bassotto, al chihuhua e all’alano, tre esponenti completamente diversi della stessa specie e che ora pagano lo scotto della “purezza” del loro patrimonio genetico visto che il primo è soggetto a problemi vertebrali causa l’innaturale curvatura cui la schiena va incontro a seguito dell’abnorme lunghezza del corpo; il secondo invece ha problemi di termoregolazione causa le troppo ridotte dimensioni corporee; mentre il terzo soffre già in giovane età di pesanti problemi articolari. Se poi si metton a confronto queste tre razze canine con alcuni canidi come lo sciacallo, il lupo o il coyote, è chiaro come si siano messe le cose.

La cosa però non riguarda solo l’ambito animale ma anche quello vegetale dove si è andata riducendo drasticamente la varietà di piante utilizzate a scopo alimentare.

5000 mila anni fa i circa 5 milioni di individui che abitavano la Terra, più di 100 volte meno di quanti ora siamo, si nutrivano utilizzando 5000 piante diverse; oggi circa 6 miliardi d’individui utilizzano meno di 150 piante, di cui 9 sono responsabili del 75% dell’alimentazione.

Il problema della selezione genetica su base di utilità o inutilità ha poi un’altra pesante ricaduta, quella della salvaguardia. E’ cosa abbastanza comune sentire dire che è importante proteggere la biodiversità perché delle migliaia di animali e piante che ancora non conosciamo ce ne potrebbero essere alcuni che potrebbero dare all’uomo sostanze veramente utili. Quindi la foresta tropicale, i fondali marini, i deserti, diventano una sorta di assicurazione sulla vita. Se non si distruggono le specie che li abitano in futuro le si potrà sfruttare favorevolmente quando verrà il momento o, molto più semplicemente, quando saranno scoperte. In pratica il concetto cambia di nome ma non di sostanza: proteggo perché in futuro mi sarà utile. Questo però non fa altro che legittimare ulteriormente la perdita della biodiversità, quantomeno a livello etico, perché non è altro che il ripetersi di quanto fatto da sempre dall’uomo. In aggiunta poi questo crea un secondo problema, cosa fare delle specie non utili?

La biodiversità ha senza dubbio un significato maggiore della semplice applicazione delle biotecnologie animali e vegetali. E’ la storia vivente del pianeta a partire dall’ultima glaciazione. Una storia fatta di una processo di selezione continuo, costante e spietato, orientato a far sopravvivere il più forte secondo canoni realmente utili. Perdere biodiversità, eliminare o tutelare la forme di vita in base alla lora utilità per noi è come riassumere un grosso romanzo privilegiando solo le parti che ci hanno interessato di più a scapito delle altre. Il romanzo perderà così di senso e significato ed il suo potenziale sarà sminuito fino a diventare una debole versione impoverita dell’originale.

Il concetto di salvaguardia della biodiversità dev’essere perciò un’applicazione pratica di un’idea ancora più grande e che come protagonista ha l’uomo, quella dello sviluppo sostenibile. Solo in questo modo preservare gli ambienti e chi li abita dalla distruzione indiscriminata avrà senso perché altrimenti non sarà altro che riempirsi nuovamente la bocca di tante e belle parole per poi però, nel profondo, portare avanti lo stesso concetto di un tempo cioé che tutto il creato esista solo per essere utile all’uomo. Nulla di più assurdo dato che l’uomo stesso è parte di questo mondo e nulla ha di più o di meno di qualunque altra specie esistente soprattutto riguardo al diritto di esistere.

]]> http://www.bottigliedileida.net/2010/12/letica-della-biodiversita/feed/ 3 http://www.bottigliedileida.net/2010/11/retrovirus/ http://www.bottigliedileida.net/2010/11/retrovirus/#comments Sat, 20 Nov 2010 16:39:32 +0000 Manuel http://www.bottigliedileida.net/?p=889 Ho deciso di dedicare questo post ad una famiglia di virus molto importanti: i Retroviridae. Preparatevi perchè sarà un bel mattone!
Perchè così tanto interesse per dei virus? Innanzitutto perchè lo studio dei virus spesso ha aiutato a comprendere alcuni importanti meccansimi molecolari, come lo splicing, la retrotrascrizione, l’oncogenesi e molto altro. Poi perchè alcuni virus sono responsabili di importanti patologie e quindi è bene che si studino per cercare di trovare delle possibili cure. At last but not the least perchè i virus possono essere usati come vettori in biologia. Ma ogni cosa a suo tempo.
Iniziamo con una descrizione generale di un Virus. Un virus è un agente infettivo che parassita le cellule. Ogni organismo vivente, dai batteri ai protozoi, dalle piante agli animali, ha i suoi propri virus. Ci sono virus specie-specifici, ovvero che infettano soltanto una singola specie e virus che hanno una minore specificità. Una volta infettata la cellula, ne utilizzano i meccanismi e le risorse per produrre quante più copie di loro stessi è possibile. Questo è, diciamo, quello che maggiormente si sa dei virus. Sono entità che è difficile classificare come organismi viventi veri e propri, ma a conti fatti lo sono. Esistono probabilmente da quando esistono le cellule, e si sono evoluti assieme agli ospiti che infettano. Nonostante vengano associati a malattie infettive mortali, il numero di virus effettivamente patogeni e pericolosi è relativamente basso. In particolare si è osservato che i virus più pericolosi sono in genere quelli che si sono evoluti più  recentemente per cui non abbiamo ancora imparato a contrastarli efficacemente. Se prendiamo invece i virus dell’influenza, a parte i casi di pandemie come quella della spagnola, difficilmente ce ne dobbiamo preoccupare, perchè coesistono con noi da centinaia di migliaia se non milioni di anni.
Solitamente sono delle particelle, di poche decine di nanometri di diametro, costituite da un involucro proteico (Capside) al cui interno è contenuto il genoma (DNA o RNA, a singola o a doppia elica). Il capside può essere a sua volta rivestito da un envelope, una membrana fosfolipidica di origine cellulare, all’interno della quale sono inserite delle glicoproteine virali.
La struttura del capside è dovuta al tipo di interazioni che le proteine che lo costituiscono hanno tra di loro. E’ stato osservato che o si presentano con struttura elicoidale oppure icosaedrica o mista.
Una volta terminato il ciclo vitale, le particelle virali (virioni) devono uscire dalla cellula ospite, e nel far questo o la lisano provocandone la morte, oppure semplicemente gemmano portandosi dietro frammenti di membrana plasmatica contenenti delle proteine virali. Queste proteine sono fondamentali al virus perchè sono il mezzo con cui il virus riconosce le cellule e le infetta, o attraverso “l’iniezione” del contenuto del capside all’interno del citoplasma o attraverso l’assorbimento dell’intero virione.
Retroviridae. A questa famiglia appartengono, appunto, tutti i retrovirus. Cos’hanno di particolare i retrovirus? Non tanto che hanno il genoma di RNA, quanto al fatto che questo genoma è presente all’interno della particella virale in doppia copia, si tratta quindi di un genoma diploide. Inoltre, questo genoma nonostante sia RNA non viene tradotto direttamente in proteine (come succede per altri virus a RNA), ma viene retro-trascritto in DNA a doppio filamento da una proteina interessantissima, la Trascrittasi Inversa o Retrotrascrittasi (RT), il DNA viene trasportato nel nucleo della cellula (Alcuni retrovirus non sono in grado di attraversare la membrana nucleare, quindi aspettano che la cellula si divida e che la membrana nucleare si dissolva) e viene integrato nel DNA dell’ospite, in posizioni casuali, ad opera di un enzima virale, l’integrasi che, assieme alla RT, è già presente assieme all’RNA genomico nel capside. Il DNA virale integrato (provirus) viene trascritto dalla RNApolimerasi della cellula ospite e vengono prodotti: RNA messaggeri che verranno maturati e tradotti in proteine, e RNA dell’intera lunghezza del genoma virale che costituirà poi il materiale genetico che verrà poi incluso nella particella virale in costruzione.
E’ un ciclo replicativo estremamente interessante ed estremamente complesso da studiare nel dettaglio (quindi lo risparmio, a meno che qualcuno non volesse approfondire l’argomento). Mi limiterò a parlare dei retrovirus in generale.
I retrovirus sono stati importantissimi per diversi motivi: il primo è che sono stati coloro che hanno abbattuto il dogma centrale della biologia molecolare, che prevedeva che l’informazione passasse invariabilmente da DNA a RNA e mai viceversa; hanno permesso la caratterizzazione di questo enzima fenomenale, che è la trascrittasi inversa, utilissima in laboratorio; grazie a loro sono stati scoperti i cosiddetti oncogeni (di cui ho parlato a bizzeffe, ma  che non mi stancherò mai di spiegare!!). Un dato interessante è che circa l’1% del nostro genoma è di origine retrovirale, e non è poco! Questo dimostra che i retrovirus ci accompagnano da molto, molto tempo.
Parliamo della trascrittasi inversa. Questo enzima è stato scoperto negli anni settanta da Baltimore e e Temin. E’ una proteina con diverse funzioni. E’ una DNA polimerasi RNA dipendente, una DNA polimerasi DNA dipendente e una ribonucleasi H (ovverossia digerisce l’RNA quando è accoppiato con DNA). Tanta roba, insomma. La RT inizia la sintesi di DNA usando come stampo l’RNA virale ed usando come primer (come innesco) un RNA transfer proveniente dalla cellula ospite che si lega all’RNA virale vicino alla sua estremità 5′ (Gli acidi nucleici hanno un’estremità 5′, cinque primo, ed un’estremità 3′, tre primo, e vengono sempre sintetizzati in direzione 5′-3′ a  partire da un primer, ovvero una sequenza di DNA o RNA che serve da innesco). Partendo da questo primer, la RT sintetizza il DNA, fino all’estremità 5′ dell’RNA virale, e qui si ferma perchè non c’è più nessuno stampo. Come ho detto prima, la RT ha anche una funzione di ribonucleasi H (ovverossia digerisce l’RNA quando è accoppiato con DNA), e questa è proprio la situazione a cui siamo di fronte, abbiamo del DNA appena sintetizzato ibridizzato con l’RNA virale. L’RNA viene degradato (non tutto, ma solo la zona ibridizzata col DNA) lasciando un filamento sporgente di DNA che si andrà ad accoppiare con l’estremità 3′ o della stessa identica molecola di RNA, oppure della sua compagna (i retrovirus hanno due copie di RNA identiche). Questo permette alla RT di continuare la sinetsi di DNA usando come primer il DNA sintetizzato all’inizio. Sintetizzato il primo filamento di DNA, l’RNA viene giustamente degradato, e deve essere sintetizzato il filamento complementare. In questo caso, i primer utilizzati sono dei primer di RNA che non sono stati completamente degradati dalla RT e che permettono il completamento del secondo filamento di DNA. Affascinante quanto complesso. Il DNA appena sintetizzato viene poi integrato nel DNA della cellula ospite.
Durante tutto questo tempo, la RT è diventata patrimonio di moltissimi laboratori di biologia molecolare e non solo. Viene utilizzata, ad esempio, per trasformare gli RNA messaggeri cellulari in DNA (cDNA) e poi su questi cDNA si possono eseguire delle PCR per quantificarli, clonarli, sequenziarli.. in questo modo si sono compresi molti processi regolativi. Attualmente ci sono dei sequenziatori automatici che sono in grado di sequenziare tutti gli RNA messaggeri cellulari presenti in un dato momento dopo averli retrotrascritti in cDNA. In questo modo si studia l’espressione genica cellulare nel tempo. Insomma, una serie di applicazioni estremamente affascinanti.
La RT inoltre non è a prova di errore, anzi! Si stima che in vivo il suo tasso di mutazione sia una ogni centomila nucleotidi. Che non è poco! Questa è la causa principale dell’evoluzione continua di questi virus.
I retrovirus sono stati anche il mezzo attraverso il quale sono stati scoperti gli oncogeni. Si stima che una buona fetta di tumori siano associabili a delle pregresse infezioni virali. Virus come quello del papilloma, quello dell’epatite B e C, il virus di Epstein-Barr (nessuno di questi è un retrovirus) sono associati rispettivamente al tumore del collo dell’utero, epatocarcinomi e Linfoma di Burkitt. Ci sono diversi modi con cui un virus può generare tumori.  Ad esempio, il virus del papilloma è cancerogeno perchè durante il suo ciclo virale produce due proteine (E6 ed E7) che inibiscono le proteine cellulari Rb e p53 (di cui ho parlato nel post: P53, il guardiano del genoma) sono due potenti oncosoppressori. Come sappiamo, se un oncosoppressore viene inibito si facilita lo sviluppo del cancro. Il virus di Epstein-Barr invece integra il suo genoma all’interno dei linfociti B dell’ospite. Se la cellula non viene lisata e se il genoma virale si è integrato in zone critiche (per esempio all’interno di un oncosoppressore, rendendolo inattivo, oppure nei pressi di un oncogene alterandone l’espressione) allora quel linfocita B può trasformarsi e diventare una cellula tumorale (anche perchè EBV produce alcune proteine, come LMP in grado di immortalizzare le cellule). Altrimenti, alcuni Virus (retrovirus) (per fortuna non ne sono ancora stati documentati sull’uomo) che vengono detti virus trasformanti acuti, portano nel loro genoma un gene estraneo, di origine cellulare, che è stato inglobato per sbaglio chissà quando durante l’evoluzione. Se questo gene è un oncogene abbiamo un’alta possibilità che la cellula infettata si trasformi. E’ questo il caso del cosiddetto Virus del sarcoma di Rous, scoperto all’inizio del ’900 da un medico americano, Rous appunto, che studiava il modo in cui un tumore del pollo si estendeva tra esemplare ad esemplare in maniera “infettiva”. Soltanto negli anni settanta si scoprì che questo virus era un retrovirus e che era così oncogeno perchè portava nel suo genoma una sequenza estranea che codificava per una proteina che è stata chiamata SRC (si pronuncia sarc, da sarcoma di Rous, appunto). SRC, che è stato il primo oncogene ad essere così scoperto,  non è una sequenza virale ma è derivata da un gene presente in moltissimi organismi, uomo compreso, ed è fondamentale nella sopravvivenza della cellula.  Come ho detto, questa sequenza deve essere stata inglobata per errore e nel tempo la forma virale (v-src) ha accumulato mutazioni su mutazioni (non sono sottoposte a selezione naturale) e che hanno reso costantemente attivata la proteina, funzionando quindi come oncogene attivato.  Con SRC si è aperto tutto un mondo all’oncologia molecolare, e se ne sono trovati tanti altri.

Ma adesso cambiamo leggermente discorso, e parliamo del più famoso dei retrovirus: HIV. Di HIV si può dire tutto, tranne che sia oncogeno. I pazienti infetti da HIV e con AIDS conclamata possono sviluppare dei tumori, ma questi non sono dovuti ad HIV quanto ad un altro virus, HHV-8, altrimenti noto come virus del sarcoma di Kaposi. Non starò qui a spiegare la patogenesi di HIV nè il modo con cui si contrae.  Se volete avere informazioni sull’epidemiologia di HIV e sulla sua diffusione vi consiglio il sito di UNAIDS. Mi limiterò a parlare di un argomento meno noto, ma molto interessante, che è l’origine di questo virus. HIV è un retrovirus, appartenente alla sottofamiglia dei Lentivirus. Da quando è scoppiata la pandemia, circa all’inizio degli anni ’80 del secolo scorso, si è cercato di capire da chi, quando e dove fosse spuntato questo virus, che prima praticamente non esisteva! I primi virus che si ipotizzò potessero essere i progenitori di HIV furono i lentivirus dei primati. In particolare, un virus subito saltò all’occhio, il SIV, o Simian Immunodeficiency Virus, che infetta una grande varietà di primati africani. Ci sono diversi SIV in circolazione. in partcolare il SIV degli scimpanzè sembra aver dato origine al HIV-1, mentre il SIV di una scimmia, il Cercocebus atys ha dato origine ad HIV-2. Perchè di HIV ce ne sono due ceppi, decisamente diversi tra di loro,  perchè derivano da due SIV diversi. l’HIV-1 è quello più diffuso e più virulento dei due. Tutte quste informazioni si sono ottenute studiando i virus dal punto di vista molecolare.
Rimane da chiarire quando e come è avvenuta la trasmissione tra scimmia a uomo. In alcune parti dell’Africa centrale è d’uso cacciare e nutrirsi di scimmie. Questa pratica può aver reso possibile l’infezione e quindi la trasmissione di quei virus che non solo erano in grado di infettare l’uomo, ma anche di passare da uomo a uomo. Non so in base a quali criteri, inoltre, sembra il primo passaggio del virus HIV dalla scimmia all’uomo sia avvenuto attorno agli anni 30 del secolo scorso, e poi portato in tutto il mondo. Teniamo anche presente che quelle zone (come del resto tutta l’africa, erano zone coloniali, è facile quindi pensare una trasmissione scimmia-> autoctoni-> colonialisti. La pandemia ha avuto un periodo di latenza abbastanza ampio, circa quarant’anni, prima di esplodere.
Un’ultima considerazione. Il tasso di mutazione di HIV è molto elevato. Quello che sorprende è che all’interno di un’unica persona infetta si sviluppano ceppi differenti di questo virus, e man mano si selezionano i più virulenti. Questo è dovuto alla bassa fedeltà con cui la RT trascrive il genoma virale.

Ok, so di avere scritto fin troppo. Spero di non avervi annoiato. Se avete domande o correzioni da fare usate i commenti!

References:

On the origin and evolution of the human immunodeficiency virus (HIV), EDWARD C. HOLMES. Biol. Rev. (2001), 76, pp. 239–254

Retroviral reverse transcriptases, Alon Herschhorn • Amnon Hizi. Cell. Mol. Life Sci. (2010) 67:2717–2747