Uno degli annosi dilemmi della biologia molecolare, molti anni fa, era la correlazione tra complessità dell’organismo e dimensioni del genoma. Un organismo complesso, si pensava, doveva possedere un altissimo numero di geni, mentre un organismo meno complesso poteva accontentarsi di un numero di geni più modesto. Ovviamente, da bravi presuntuosi quali siamo, l’essere umano doveva averne, come minimo, un centinaio di migliaia. Non di meno.
La stima che venne eseguita, però, parlava di ben altre cifre: circa 25-30’000 geni. Se poi si andavano a guardare altri esseri viventi si scopriva che il moscerino della frutta ne possiede circa 15 mila e un vermiciattolo (il nematode C. elegans) circa 20 mila. Brutta storia. E’ chiaro che non si può tentare di spiegare la complessità con dei semplici numeri o con delle mere classifiche.
Alla fine degli anni settanta venne inoltre confutata la definizione di gene classica che la maggior parte di noi conosce “Un gene = Una proteina” con la scoperta dello splicing alternativo.
La scoperta dello splicing alternativo poteva essere una spiegazione alternativa alla complessità degli organismi. Cos’è lo splicing alternativo? E ancora prima, cos’è lo splicing?
La scoperta dei geni interrotti, negli eucarioti, è stato il primo passo per comprendere lo splicing. I geni degli eucarioti non sono costituiti da una sequenza codificante lineare e ininterrotta, dal codone di inizio a quello di stop. Sono costituiti da pezzi codificanti interrotti da pezzi non codificanti. I primi pezzi vengono chiamati esoni, i secondi introni. Quando il gene viene trascritto, viene trascritto tutto quanto esoni più introni. In media, nell’uomo, ogni gene è costituito da 9 esoni e 8 introni. Ma è soltanto una media. Il gene ErbB4, nell’uomo, ha 28 esoni, e non è neanche quello che ne ha di più.
Il trascritto così formato non può essere subito tradotto in proteina, per ovvi motivi: i ribosomi hanno bisogno di leggere una ORF (open reading frame, nota come cornice di lettura) continua, non saltellante. Per questo l’RNA messaggero appena formato viene subito processato. Il processamento o processing avviene sempre nel nucleo e consta di tre fasi: il Capping, la Poliadenilazione e lo Splicing.
Il capping consiste nell’aggiunta all’inizio dell’RNA (al 5′) di una 7-metil guanosina, ma non attraverso il solito legame 3′-5′, ma con l’insolito 5′-5′. Questo cap ha il compito di proteggere l’RNA dalla degradazione e di regolare il trasporto dello stesso fuori dal nucleo per la traduzione.Funzione simile ha la poliadenilazione, ovvero l’aggiunta di qualche centinaio di residui di adenosina alla fine del trascritto (3′).
Veniamo allo splicing. Questo processo consiste nel staccare selettivamente gli introni e unire conseguentemente gli esoni, formando così il trascritto maturo che potrà essere tradotto.

Il meccanismo dello splicing è estremamente complesso e non starò a parlarne, perché credo che per chi non studi espressamente biologia molecolare non sia interessante (se però, nonostante questi avvertimenti, vorrete saperne di più chiedete pure!). Quello che mi limiterò a dire è che possono esistere due forme di splicing, uno per così dire autonomo, ovvero che non necessita elementi esterni, ed uno guidato da un complesso macchinario formato da proteine ma soprattutto da RNA stesso, ovviamente non codificante. E’ questo uno dei casi in cui è l’RNA non le proteine ad avere un ruolo da catalizzatore. L’altro caso è ovviamente il ribosoma. Il ribosoma e lo spliceosoma (ovvero il macchinario che catalizza lo splicing, sì lo so che è una parola orribile) possono essere delle vestigia del cosiddetto RNA world, precedente alla comparsa del DNA.
La domanda che vi potete essere posti è: come si riesce a distinguere un esone da un introne, e soprattutto come si riesce ad individuare correttamente la fine di un esone e l’inizio di un introne. Non è così semplice. Innanzitutto, studi comparativi (ovvero che prendevano in esame un gran numero di sequenze) hanno tracciato dei profili più o meno conservati di giunzione esone-introne. Ovvero di quella manciata di nucleotidi a cavallo tra la fine di un esone e l’inizio di un introne e viceversa.

La figura evidenzia un sito di splicing al 5′ e un altro al 3′ dell’introne, entrambi sono fondamentali per il distacco dell’introne e la congiunzione degli esoni.
Vi potrete chiedere se questa sequenza sia fissa ed immutabile per tutti i geni. Il diagramma che vi metterò ora vi darà la risposta:

Come si interpreta? Le dimensioni delle lettere sono proporzionali alla loro frequenza, quindi, ad esempio, nella posizione 7 dell’introne (il settimo nucleotide dall’inizio dell’introne) tutti i nucleotidi sono equivalenti, questo ci fa presupporre che non sia una posizione utile allo splicing, mentre nella posizione -1, 1 e 2 abbiamo quasi esclusivamente GGT. Questi devono essere i nucleotidi più importanti perché più conservati. Seguiti dalla A in -2 e in 3 e 4 e dalla G in 5. Sembra strano che così pochi nucleotidi bastino a garantire la specificità richiesta.
Abbiamo altre sequenze però, come il tratto di polipirimidine (py tract) e il punto di ramificazione. Numerose malattie genetiche e tumori sono dovuti a difetti nello splicing, si stima che siano circa il 15%.Ma veniamo ora allo splicing alternativo. E’ questo un fenomeno molto interessante e consiste nella possibilità per un gran numero di geni di dare origine a diversi prodotti, o isoforme, alcune correlate funzionalmente tra loro, altre invece completamente diverse. Lo splicing alternativo non è un eccezione, è la regola. Si stima che più del 70% dei geni nell’uomo vada incontro a questo fenomeno (ci sono stime diverse, ovviamente in base alle tecniche utilizzate per ottenerle). Come è possibile arrivare a questo? Il modo più comune, forse, è quello di eliminare uno o più esoni dal trascritto primario, generando così un’isoforma più corta; oppure trattenendo un introne tra due esoni, anziché eliminarlo; o anche, grazie alla presenza di siti di splicing alternativi, la formazione di esoni/introni di diversa lunghezza. Normalmente distinguiamo esoni e introni costitutivi e sono esoni e introni sempre presenti/assenti nel trascritto maturo. Esistono poi i cosiddetti esoni/introni opzionali che possono o meno venire inclusi. Inoltre ci sono dei casi in cui la presenza nel trascritto maturo di un esone implica necessariamente l’assenza di un altro esone, in questo caso parliamo di esoni mutualmente esclusivi. Questo ovviamente può generare una varietà enorme di trascritti. Ci sono geni anche con decine di varianti diverse, ciascuna delle quali darà origine a proteine diverse. Quindi non solo il concetto del gene è stravolto (e venne stravolto molte volte ancora, per gli interessati ho da consigliare un ottimo articolo sull’evoluzione del concetto di gene negli anni) ma anche si riuscì a capire come da un numero relativamente modesto di geni si generasse una varietà così grande di proteine. La domanda da farsi ora è: cosa decide se un esone/introne debba essere incluso o meno? E’ un discorso estremamente complesso che vede in gioco un numero molto alto di fattori. Cercherò di semplificarlo al meglio.
Ci sono all’interno degli esoni e degli introni delle sequenze, anche molto lunghe, che vengono distinte in due classi: gli splicing-enhancers (SE) e gli splicing-silencers (SS). Queste sequenze giocano un ruolo fondamentale. Vengono riconosciute da numerose proteine (delle RBPs, RNA-binding-proteins) le quali possono influenzare lo splicing. In che modo? Vediamolo.
Le sequenze SE possono essere introniche od esoniche; a queste sequenze si legano delle proteine appartenenti alla famiglia SR (serin-rich, ricche di serina, un amminoacido), a loro volta queste proteine reclutano sul trascritto immaturo i componenti dello spliceosoma (il macchinario che catalizza lo splicing). Lo spliceosoma riconosce i siti di splicing 5′ e 3′ (vedere la figura due), in questo modo lo splicing può avvenire attraverso l’eliminazione dell’introne e la congiunzione degli esoni, secondo lo schema classico. Se in un trascritto immaturo funzionassero soltanto le sequenze SE, per forza di cose tutti gli esoni sarebbero tenuti e tutti gli introni eliminati.
Per far sì che ci possa essere lo splicing alternativo, ci sono anche le SS. Queste sequenze legano alte proteine, le quali coprono fisicamente sia le SE sia i siti di splicing 5′ e 3′ , in questo modo lo spliceosoma non può legarsi. Questo cosa comporta? Semplicemente che l’esone nel quale le SS sono attive, non verrà riconosciuto dallo spliceosoma, il quale si legherà alle sequenze di splicing più vicine a monte e a valle dell’esone; la regione compresa tra queste due sequenze, quindi con l’esone compreso verrà trattata come se fosse un introne e verrà eliminato dal trascritto.
Il tutto si gioca sull’equilibrio tra SS e SE e sulle proteine che legano queste sequenze. In base alla prevalenza di una famiglia di proteine sull’altra si avrà la ritenzione o l’eliminazione dell’esone. In questo quadro, potrebbe essere influente anche la velocità alla quale il trascritto viene sintetizzato dall’RNA polimerasi, perchè in questo modo alcune sequenze potranno essere disponibili con tempi diversi e potranno competere tra di loro.

Da quanto detto se ne deduce che:

*Un esone può venire incluso o escluso dal trascritto maturo in base all’equilibrio SE-SS.
*Due esoni mutualmente esclusivi saranno regolati in base alle competizione tra le loro sequenze e i loro siti di splicing. Supponiamo di avere un esone A e un esone B, ciscuno con le sue SE e SS. Nel caso degli esoni mutualmente esclusivi, le sequenze dell’uno “influenzano” il destino dell’altro. Per cui, ad esempio, se l’esone A riesce a legare più proteine di B sulle sue ES, esclude l’esone B, e viceversa. Ovviamente prendete con le pinze il “riesce”, non è una gara, è soltanto una questione di equilibrio.
Lo splicing alternativo è, come dicevo, molto diffuso. Una cosa che è importante sapere è che è anche tessuto-specifico. Questo significa che tessuti diversi esprimono isoforme diverse dello stesso gene attraverso splicing alternativi.  Infatti l’analisi dello splicing in diversi tessuti permette di stabilirne l’origine. Come è possibile manatenere splicing diversi in tessuti diversi? Molto spesso è dovuto all’espressione di fattori di splicjng diversi da tessuto a tessuto e questo determina eventi di splicing specifici. Il sistema nervoso è forse il tessuto che presenta il più alto grado di splicing alternativo tessuto specifico. Anche all’interno dello stesso sistema nervoso ci sono aree con diversi pattern di splicing.

Voglio concludere questo papiro con un esempio estremo di splicing alternativo. Questa volta non sarà l’essere umano ‘esempio, ma il nostro amico Drosophila.  Il moscerino, durante lo sviluppo del suo sistema nervoso esprime una proteina chiamata “Dscam”. Questa proteina, espressa sui neuroni in via di sviluppo, è un recettore appartenente alla famiglia CAM (cell-adhesion-molecules), è quindi una proteina che media l’adesione cellula-cellula. Il gene di questa proteina è forse il più complesso gene che si sia mai visto, avendo ben 38016 varianti di splicing, solo lui. Se la drosophila ha circa 15 mila geni, solo dscam ha più varianti che tutti i suoi geni messi assieme. Questo perchè il gene in questione ha tre esoni, il 4, il 6 e il 9 che hanno rispettivamente 12, 48 e 33 varianti mutualmente esclusive, quindi soltanto una variante per esone è mantenuta nel trascritto maturo. Non ho fatto il calcolo combinatoriale, per cui non so dirvi se vengono effettivamente 38 mila e passa varianti, ma confido che chi l’ha fatto l’abbia fatto giusto.  Spaventoso, vero? Non solo spaventoso, direi anche meraviglioso. Alla faccia di chi crede che solo l’uomo e i mammiferi sono degni di essere studiati. Ciascun neurone esprime una sola variante di splicing, e questo è necessario per mantenere l’identità neuronale stessa. Non credo che esistano due neuroni con la stessa isoforma Dscam. Non è ancora chiaro se la scelta venga fatta casualmente.

Spero di essere stato interessante, nonostante la lunghezza dell’articolo. come sempre se avete domande fatele! se desiderate saperne di più chiedete, posso consigliarvi numerosi articoli. Se notate errori, per favore, fatemelo sapere nei commenti. Alla prossima e Buone vacanze!

Sebbene sia da parecchio tempo che non tocco la tossicologia, volevo scrivere qualcosa di interessante e curioso e magari, spero, di divertente.
In ogni caso potrebbe sempre servirvi in caso voleste uccidere un professore, il cane del vostro vicino che vi fa sempre i bisogni davanti alla porta, il vostro vicino che glielo lascia fare, la vostra suocera, il vostro genero o la vostra nuora, insomma..chi vi pare.. e poi non venitemi a dire che non sono una brava persona!

E’ noto che alcune popolazioni dell’amazzonia utilizzano un veleno, estratto da diverse piante (in particolare il Chondodendron tomentosum), con cui intingono le punte delle frecce. In questo modo aumentano la resa della caccia in quanto l’animale, oltre che ferito viene anche avvelenato.La tossina in questione è la tubocurarina (in quanto il veleno viene chiamato curaro).

Questo alcaloide vegetale si lega al recettore nicotinico dell’acetilcolina presente sui muscoli scheletrici e lo blocca. Il recettore in questione è una proteina multimerica (formata da diverse subunità distinte) presente in quelle zone delle fibre muscolari che vengono contattate dagli assoni dei neuroni motori (giunzione neuro-muscolare). Quando arriva un impulso nervoso, il terminale assonico libera il neurotrasmettitore acetilcolina (Ach), il quale, essendo liberato direttamente sul muscolo, si lega a questo recettore, che è molto concentrato proprio a questo livello. Il recettore attivato, essendo un canale ionico, depolarizza la membrana della cellula muscolare innescando la contrazione. La tubocurarina si lega al recettore, impedendo così l’azione dell’Ach. Il risultato è ovviamente la paralisi totale dei muscoli (una paralisi dovuta all’assenza di contrazione). In questo modo l’animale ferito non potrà allontanarsi più di tanto. Una cosa che gli indigeni sanno è che il curaro, anche se letale iniettato, è innoquo quando viene ingerito. Cibarsi di animali uccisi col curaro non è quindi pericoloso. Veniva anche utilizzato nelle pratiche chirurgiche, per la sua azione miorilassante. Ha una dose letale 50 (la dose che uccide metà degli esposti) di 0.63 mg/Kg per i topi.
Sempre parlando dell’acetilcolina, arriviamo all’interessante discorso degli organofosfati. Gli organofosfati (OP) sono, chimicamente, degli esteri dell’acido fosforico (estere = gruppo alcolico + acido). Un OP è ad esempio l’ATP. Alcuni OP hanno dei potenti effetti neurotossici. Il loro obiettivo è l’enzima acetil-colinesterasi, presente a livello delle sinapsi colinergiche (che utilizzano Ach), quindi anche quelle neuromuscolari;il suo scopo è quello di rimuovere l’acetilcolina rilasciata per interromprne gli effetti. Come vedremo se l’Ach persiste a livello delle sinaspi ci potrebbero essere numerosi problemi. l’Ach-esterasi ha quindi un ruolo di modulatore della risposta colinergica.
Gli organofosfati inibiscono reversibilmente o irreversibilmente questo enzima.Così facendo il neurotrasmettitore persiste molto più a lungo del dovuto nelle sinapsi causando un iperattivazione dei recettori nicotinici dell’Ach.Il risultato è un blocco di tutte le sinapsi colinergiche, quelle muscolari, quelle del sistema nervoso centrale, ecc.. Uno degli effetti principali è pertanto la paralisi (per eccessiva contrazione, all’incontrario di prima) accompagnata da convulsioni, perdita di coscienza e successivamente la morte. Il tutto avviene in pochissimo tempo, una manciata di minuti.
Gli organofosfati sono meglio noti col nome di gas nervini, di cui tutti conosciamo la storia. Alcuni di essi sono il Sarin, il Tabun e il Soman. Sono tutti agenti volatili (per questo sono gas) e hanno una dose letale 50 (ovvero la dose che uccide metà degli esposti) tra gli 0.04 e gli 0.6 mg/Kg (per le cavie). Il sarin è stato usato nell’attentato  terroristico del 1995 alla metropolitana di Tokyo uccidendo 12 persone.
Anche alcuni insetticidi si basano sugli OP, sono estremamente tossici, anche per l’uomo, ma come immaginerete sono molto efficaci.

Infine, per rimanere in tema, non mi resta che parlarvi di due delle tossine più potenti che esistano in natura: la tossina botulinica e quella tetanica. Innanzitutto, sono prodotte da due batteri, simili tra loro, il Clostridium botulinum e il Clostridium tetani. Sono dei batteri anaerobi e sporigeni (in caso di necessità producono spore molto resistenti). Producono due tossine di natura peptidica. La tossina botulinica è forse il veleno più potente che esista, poichè 450 grammi basterebbero per uccidere ogni essere umano di questo pianeta.  Di solito contamina cibi mal conservati.
La tossina botulinica penetra nelle terminazioni dei motoneuroni (quelli che innervano i muscoli) e tramite la sua azione proteasica taglia una proteina fondamentale per il rilascio dell’Ach, la SNAP-25. L’Ach, non essendo più liberata, non può attivare i recettori muscolari e questo causa una paralisi.
L’azione della tossina tetanica è simile, solo che al posto di inibire il rilascio di Ach, inibisce, allo stesso modo, il rilascio del GABA (per vedere cos’è il GABA e come funziona leggere il mio post sull’epilessia). Essendo un neurotrasmettitore inibitore, il tetano causa improvvise e prolungate contrazioni muscolari che portano alla paralisi e alla morte. La tetania, infatti, è la condizione nella quale i muscoli sono contratti.

Nella speranza di non farvi venire gli incubi, vi saluto. Come sempre, le domande sono ben accette!

Decisamente non siamo sul ring, ma in un laboratorio. Non ci sono due mastodontici contendenti pronti a darsele di santa ragione, ma un ricercatore e il suo stuolo di topi da laboratorio. Il Knock-Out (KO) è una tecnica sperimentale molto interessante e utile e permette di inattivare o sostituire singoli geni nei cromosomi con una precisione chirurgica.
Volete sapere che funzione abbia un gene in un particolare processo? Cosa c’è di meglio che toglierlo e vedere cosa succede? E’ possibile fare un knock out su singole cellule, ma è possibile anche creare degli organismi fatti e finiti (quando va bene) knock-out.
Per comprendere bene questa tecnica è necessario conoscere la ricombinazione e approfitto di questa occasione per parlarne un po’.
La ricombinazione è un processo che prevede lo scambio di due segmenti genici. Può avvenire all’interno dello stesso cromosoma o avvenire tra due cromosomi diversi. La ricombinazione è uno dei meccanismi attraverso il quale si forma la variabilità genetica. Uno dei più importanti eventi di ricombinazione avviene durante la meiosi (quando cioè i progenitori delle cellule germinali si dividono dando origine ai gameti); in questo caso viene anche chiamata crossing over ed è il meccanismo con il quale segmenti di DNA vengono scambiati tra due cromosomi omologhi. Questo è per creare gameti con un genotipo diverso da quello delle cellule di partenza. Ricombinazioni di questo tipo sono dette ricombinazioni omologhe, perchè sono omologhe le sequenze che si scambiano. Cosa vuol dire? Vuol dire che un allele del gene A sul cromosoma 10 paterno viene scambiato con l’altro allele (che potrebbe anche essere lo stesso) del gene A sul cromosoma 10 materno (ricordo che abbiamo due copie del nostro patrimonio genetico, uno di origine paterna e uno di origine materna). In questo modo è come avere due mazzi di carte e mischiarli ogni volta in modo diverso, otteniamo combinazioni diverse ogni volta. Esiste anche una ricombinazione non omologa, che prevede lo scambio tra due segmenti di DNA casuali.
Apro una digressione che esula un po’ dall’argomento principale, ma è decisamente interessante. La metto in corsivo così la potete saltare se volete, visto che non è indispensabile per capire il resto del post.

I primi importanti studi sulla ricombinazione genetica o crossing over vennero fatti all’inizio del secolo scorso da Morgan e colleghi. Loro lavoravano sui moscerini della frutta (Drosophila melanogaster) e fecero alcune fondamentali scoperte sulla frequenza di ricombinazione. La frequenza di ricombinazione è la frequenza con cui si verifica una ricombinazione tra due loci durante la meiosi e quindi la frequenza con cui si vengono a creare combinazioni di geni diverse da quelle di partenza. In parole povere la frequenza con cui due geni vengono separati durante la ricombinazione.
Per fare un esempio, due geni presenti su cromosomi diversi sono indipendenti l’uno dall’altro e vengono ereditati indipendentemente. Per cui due individui omozigoti con genotipo AABB e aabb (dove A e a e B e b sono due alleli rispettivamente del gene A e B localizzati su due cromosomi differenti) producono gameti AB e ab. Se li incrociamo avremo una progenie AaBb la quale a sua volta produrrà dei gameti AB, aB, Ab e ab con la frequenza del 25% ciascuno. Questo perchè i due geni sono indipendenti, vengono ereditati dalla progenie indipendentemente, per cui per calcolare le frequenze attese basterà usare la legge degli eventi indipendenti (la probabilità che si verifichi un evento A moltiplicata la probabilità che si verifichi un evento B). In questo caso la frequenza di ricombinazione è del 50% perchè su quattro combinazioni della progenie (AB, Ab, aB, ab) ben 2 su 4 sono diverse da quelle dei genitori di partenza (Ab e aB) e quindi nel 50% dei casi si è verificata la ricombinazione tra quei loci.
Se prendiamo due geni C e D localizzati sullo stesso cromosoma,potremmo non avere gli stessi risultati perchè se sono sufficientemente vicini possono essere ereditati in blocco e pertanto non siamo più nel caso degli eventi indipendenti. In questo caso la frequenza di ricombinazione sarebbe più bassa del 50%.
Questo ultimo punto sarà più chiaro tra poco. Bene, Morgan e colleghi osservarono che nei moscerini della frutta la frequenza di ricombinazione tra una coppia di geni rimaneva sempre costante durante tutte le generazioni e le frequenze di ricombinazione tra coppie di geni ogni volta diverse erano diverse tra loro. Questo voleva dire due cose: che la distanza tra due geni era sempre costante e che la frequenza di ricombinazione poteva essere usata come misura della distanza tra due geni.
Mi spiego meglio: più due geni sono vicini sullo stesso cromosoma, più la frequenza di ricombinazione sarà bassa (è meno probabile che quei geni vengano separati durante il crossing over e che diano origine a combinazione diverse, è più probabile che vengano ereditati insieme), più due geni sono distanti sullo stesso cromosoma più la frequenza di ricombinazione sarà alta, il caso estremo è quando i geni sono su due cromosomi diversi (è più probabile che quei due geni vengano separati). Per tornare al punto di prima, più due geni sono vicini maggiore è la possibilità che vengano ereditati in blocco e quindi le loro distribuzioni nella progenie non sono più eventi indipendenti.
Queste scoperte fecero venire in mente a Morgan di potere usare la frequenza di ricombinazione come misura della distanza tra due geni e in questo modo si iniziarono a fare mappe dettagliate sulla disposizione dei geni lungo i cromosomi. Viene ancora usata l’unità di misura del centimorgan che è la probabilità dell’1% che due loci vengano separati durante la ricombinazione ed equivale in media ad un milione di paia di basi.

Mi rendo conto che è stata una digressione lunga e forse non troppo semplice da capire, non era prevista nella mia idea originale di Post; è stata un’evoluzione spontanea :)… se non vi fosse chiaro  fate pure domande!

Ma ritorniamo al nostro punto principale, il Knock-out.  Per generare un animale Knock-out, quindi privati di un gene, è necessario fare diverse cose. D’ora in avanti darò per scontato che l’animale di cui si parla è il topo, che è quello che più frequentemente viene utilizzato.
Allora, per eliminare un gene è necessario prima di tutto preparare in laboratorio una versione dello stesso ma con un difetto che lo renda inattivo. Il modo più facile è introdurre all’interno del gene un altro gene che gli dia una qualche proprietà, come una resistenza ad un antibiotico in modo poi da poter effetturare una selezione positiva. Ai lati di questo costrutto si inseriscono due regioni omologhe a quelle del gene che devo sostituire per rendere possibile la ricombinazione omologa, per far sì che quel gene modificato si vada a sostituire al gene voluto e non in una regione casuale del genoma. Infine è buona norma inserire al di fuori delle sequenze di ricombinazione un gene letale per la selezione negativa. Per chiarire ho fatto un semplice schema (è ridicolo, lo so):

Legenda:

Rosso: costrutto
Blu: sequenze di ricombinazione
Giallo: gene originale
Verde: Gene per la resistenza agli antibiotici (selezione positiva)
Nero: gene letale (selezione negativa)

Questo costrutto viene inserito in diverse cellule staminali embrionali, prelevate da una blastocisti di topo, all’interno delle quali, se tutto va bene, avremo la ricombinazione del gene modificato con il gene originale e l’eliminazione di quest’ultimo. Alla fine il risultato sarà che, le cellule che hanno avuto la ricombinazione omolga saranno resistenti all’antibiotico, quelle che non hanno avuto la ricombinazione moriranno se esposte all’antibiotico e quelle che hanno avuto una ricombinazione casuale, hanno incorporato anche il gene letale e moriranno per questo. Con il gene per la selezione positiva e quello per la selezione negativa abbiamo quindi isolato le cellule che hanno avuto la ricombinazione omologa (approssimativamente 1 su 10 alla quarta)

Le cellule sopravvissute però sono eterozigoti, per chè la ricombinazione avviene solo su uno dei due alleli.
Queste cellule vengono fatte proliferare in vitro e vengono impiantate in un embrione di topo ricevente con alcune caratteristiche genetiche appositamente diverse, come ad esempio il colore del pelo. I topi che nasceranno saranno dei topi chimerici, con caratteristiche sia del ricevente, sia del donatore.
Quello che a questo punto si fa è incrociare un topo chimerico con un  topo albino  Si otterrà una progenie mista, distinguibile dal colore del pelo. I topi col pelo dello stesso colore del topo da cui si sono ricavate le cellule staminali che sono state modificate geneticamente saranno i topi Knock out. Ma sono eterozigoti, ricordate? A noi servono gli omozigoti. Quindi si incrociano due eterozigoti e si otterranno, tra gli altri, dei topi omozigoti per il gene Knock-out.
A volte, però, qualcosa va storto, e non abbiamo nessun animale Knock-out omozigote. E’ evidente che in questo caso, il gene che è stato tolto era fondamentale per l’animale e che quindi quelli privi di quel gene non sono sopravvissuti durante lo svliluppo embrionale. A volte non sopravvivono nemmeno gli eterozigoti.
Ci sono degli escamotage per ovviare a questo inconveniente, come i Knock-out condizionali. In questo caso è possibile far nascere e crescere i topi, e solo secondariamente inattivare il gene (cre-lox). E’ possibile fare anche un Kncok out tessuto specifico, ovvero inattivare il gene solo in un tessuto (sistema nervoso, miocardio, ecc ecc).

Come avete visto, a parte la digressione iniziale, fare un knock out non è così semplice. Gli imprevisti sono sempre alle porte e richiede anche abbastanza tempo (diverse generazioni di topo). Ma è assolutamente indispensabile per la comprensione di molti processi.
Finalmente (per voi) ho finito questo interminabile poema. Come sempre sono aperto alle critiche. Se notate errori ditemelo e se non capite chiedete! i commenti sono fatti per questo!

Un’ultima cosa, uno dei primi a sviluppare la tecnica del knock out è stato Mario Capecchi, un italiano premio nobel!!

Adios

[…]Poi, improvvisamente, una voragine si aprì sotto i suoi piedi e una straordinaria luce interiore gli illuminò l’anima.Quell’abbaglio non durò più di mezzo secondo;ma il Principe, in seguito, si ricordò chiaramente dell’urlo spaventoso e incontenibile che gli uscì dal petto.Poi la sua coscienza si spense e tutto si fece tenebra.

‘L’idiota’ F. M. Dostoevskij

Con questa straordinaria citazione apro un articolo riguardante l’epilessia. L’epilessia è un disturbo del sistema nervoso centrale. Oggigiorno colpisce più di cinquanta milioni di persone nel mondo (stime della WHO), anche se credo che come sempre siano stime al ribasso.
Quando uno o più gruppi di neuroni, solitamente della corteccia, ma possono essere anche più profondi, presentano un’eccessiva e sincronizzata attività elettrica si profila il rischio di sviluppare un attacco epilettico, caratterizzato dalla presenza di convulsioni e da eventuale perdita di coscienza.
Le convulsioni sono contrazioni involontarie dei muscoli scheletrici, possono essere localizzate (riguardare cioè gruppi di muscoli separatamente) o generalizzate (riguardare tutti i muscoli del corpo). Normalmente non sono pericolose per la vita, anche se si possono avere difficoltà respiratorie.Le convulsioni non sono necessariamente manifestazione di un attacco epilettico, perché possono generarsi anche per altri motivi: traumi cerebrali, ictus, tumori al cervello, intossicazioni ecc..
Non mi interessa, in questo post, parlare di tutti i tipi di convulsioni esistenti e di tutti i tipi di epilessia esistenti, sappiate che sono innumerevoli e se volete saperne di più la voce di wikipedia al riguardo è molto ben fatta (quella inglese). Mi interessava parlare delle cause. Non che il discorso sia più semplice, anzi!
L’epilessia, nei termini più generali, è una malattia complessa e multifattoriale. Non si conoscono ancora tutti i meccanismi che la provocano, quello che si è scoperto e che le ricerche confermano sempre di più è che in molti casi ha una forte base genetica.
Per capire meglio i meccanismi d’insorgenza della patologia, vorrei fare un piccolo excursus, ma proprio piccolo, sulle sinapsi e sui neurotrasmettitori.

Come molti di voi sanno, il sistema nervoso (centrale e periferico) funziona attraverso la generazione e la propagazione di impulsi elettrici, vere e proprie scariche di corrente che decorrono lungo tutto l’assone. La terminazione dell’assone forma una sinapsi, ovvero un contatto molto stretto, con un altro neurone o con una cellula effettrice (fibra muscolare, recettore sensoriale ecc..). A livello della sinapsi possiamo distinguere una membrana presinaptica, uno spazio intersinaptico di circa 20nm e una membrana postsinaptica. Questo sistema serve a propagare da una cellula alla successiva l’impulso elettrico, nonostante ci sia un’interruzione.
In un encefalo umano si stima possa esserci un numero di sinapsi dell’ordine di grandezza di 10¹⁴. A tenere stabili le sinapsi ci sono numerose molecole di adesione che tengono adesi i due lembi di membrana cellulare.
Solitamente per sinapsi si intende una sinapsi chimica, che funziona cioè con un neurotrasmettitore (NT). Queste sono quelle più diffuse, ma esistono anche delle sinapsi elettriche, dove non c’è nessun neurotrasmettitore. Di queste non ci occupiamo.
Il neurotrasmettitore è la molecola responsabile della propagazione dell’informazione da un neurone alla cellula successiva mediante impulso elettrico. Rilasciato dal terminale presinaptico all’arrivo dell’impulso, si diffonde nello spazio tra le due membrane e si lega a dei specifici recettori posti sulla membrana postsinaptica. L’attivazione del recettore determina l’effetto sulla cellula postsinaptica.
So che queste cose sono note e risapute, ma portate ancora un po’ di pazienza e arrivo al dunque.
Ci sono tantissimi NT, alcuni di essi sono in grado di indurre nella cellula postsinaptica un altro impulso elettrico, altri invece sono in grado di inibirlo. Parliamo quindi di NT eccitatori (come glutammato, acetilcolina) e inibitori (come GABA e Glicina).

E’ ormai noto che difetti nel signaling del neurotrasmettitore GABA sono associati all’epilessia. In molti pazienti si sono riscontrati deficit nella biosintesi e nella trasmissione di questo NT, che è il più importante NT inibitorio del Sistema Nervoso Centrale.
Il GABA, acido gamma-ammino-butirrico, è ottenuto dall’acido glutammico (o glutammato, che oltre ad essere un neurotrasmettitore è più comunemente un amminoacido) mediante l’enzima Acido Glutammico Decarbossilasi (GAD). Viene immagazzinato in vescicole nel terminale presinaptico e una volta rilasciato si può legare a diversi recettori (GABARs): GABA_AR, GABA_BR e GABA_CR. l’A e il C sono due canali specifici per il Cl^-, quando vengono attivati quindi lasciano passare all’interno del neurone postsinaptico grandi quantità di ioni cloro (nel SNC a completo sviluppo [Cl^-]_e>[Cl^-]_i ovvero la concentrazione di cloro extracellulare è maggiore di quella intracellulare, mentre durante lo sviluppo è esattamente l’incontrario, questo fa sì che il GABA durante lo sviluppo embrionale sia un NT eccitatorio). L’entrata di cloro nella cellula rende più negativo il potenziale di membrana (attenzione, non centra nulla il fatto che il cloro abbia una carica negativa con questo), e poiché per generare un impulso elettrico il potenziale di membrana deve shiftare verso valori più vicini allo zero, capite bene come il GABA inibisca tutto ciò.
Il Recettore GABA_B non è una proteina canale, bensì un recettore accoppiato a proteine G e la sua attività è sempre inibitoria.
E’ curioso notare come sia il recettore A che il C sono sensibili a numerose molecole, quali l’alcol (etanolo) il quale aumenta l’attività del GABA (ubriacarsi ha quindi un effetto inibitorio sul SNC), barbiturici e benzodiazepine (idem come per l’alcol).

Bene, ora che ho fatto questa panoramica sulle sinapsi e sui NT, in particolare il GABA, credo risulti abbastanza chiaro come una mancata inibizione da parte delle sinapsi GABAergiche possa portare ad un’eccessiva attività alcuni gruppi di neuroni (è come se questi neuroni perdessero un freno). Questo può portare a sviluppare movimenti incontrollati dei muscoli. Il discorso, se vogliamo, è simile a quello che si potrebbe fare per il morbo di Parkinson, caratterizzato da un tremolio involontario della muscolatura e da ipocinesia. In questo caso si ha una degenerazione di un gruppo di neuroni nel nostro encefalo che formano un nucleo chiamato Substantia nigra (perché è di un colore nerastro); questi neuroni sono dopaminergici (funzionano rilasciando Dopamina) e la loro perdita causa un’inibizione dei segnali motori.
Ma torniamo all’epilessia, che è già abbastanza complicata di per sè, senza che ci infiliamo di mezzo anche il Parkinson. Sono state osservate numerose mutazioni a carico dei geni che codificano per le varie subunità che costituiscono i vari recettori del GABA. Queste mutazioni diminuiscono l’efficienza della trasmissione GABAergica aumentando il rischio di sviluppare epilessia.
Ci sono mutazioni implicate in tale patologia che colpiscono numerose altre proteine, però.. non dobbiamo pensare che solo i recettori del GABA siano responsabili. Ad esempio, alcuni canali (non recettoriali, questa volta) per il sodio implicati nell’eccitazione neuronale. Quando questi canali si attivano, il sodio entra nella cellula, il potenziale di membrana si sposta verso lo zero, e questo determina la generazione dell’impulso nervoso. Mutazioni che aumentano l’attività di questi canali, o ne rallentino la chiusura sono correlate all’epilessia.

Una piccola digressione sulle terapie farmacologiche. Ora si tendono a prescrivere farmaci anticonvulsivanti, diretti soprattutto a potenziare l’azione del recettore GABA, in particolare le benzodiazepine.
E’ anche in corso di sperimentazione una terapia non farmacologica, che si basa sulla modificazione della dieta dei soggetti epilettici, in particolare bambini. Questa dieta, chiamata Ketogenic Diet, o dieta chetogenica in italiano, prevede una dieta ricca di grassi, intervallata a periodi di digiuno. Questo farebbe innescare un metabolismo chetogenico; i chetoni sono dei composti chimici che si formano quando assumiamo eccessive quantità di grassi (portandone a saturazione il metabolismo).
I chetoni avrebbero un effetto anticonvulsivante. Ci sono effetti collaterali, come disturbi gastrointestinali e, nei casi più gravi, disturbi nella crescita e problemi al sistema immunitario. Non vi so dire se potrà un giorno rappresentare una valida alternativa ai farmaci, si vedrà.

Ok, ora ho davvero finito. Spero che sia stato un discorso interessante. Se avete domande fatele! se avete dubbi o critiche, non tiratevi indietro… Alla prossima.

Immaginate di vivere in un mondo in cui la morte sia un evento programmato alla perfezione e soprattutto è un qualcosa che tu stesso metti in atto e non perchè improvvisamente ti sia venuto un attacco di depressione, ma lo fai per il bene della collettività; può anche capitare che ci sia qualcuno che ti dica “ucciditi” e tu gli ubbidisca come se nulla fosse.
Spero vivamente di non sbagliarmi quando dico che sembra una situazione uscita da qualche libro di fantascienza. Però la fantascienza diventa realtà quando parliamo di cellule.
Ebbene sì, forse qualcuno di voi lo saprà già, forse ne avrete solo sentito parlare, ma in un organismo pluricellulare, dal più semplice al più complesso, la morte cellulare programmata è un evento fisiologico imprenscindibile. Il motivo per cui si sia evoluto un meccanismo automatico e irreversibile di morte cellualre mi sembra abbastanza chiaro. Sia come mezzo di difesa, ad esempio quando le cellule vengono infettate da virus, sia come mezzo di controllo numerico delle cellule, sia come mezzo di selezione negativa.
Nel primo caso, quando una cellula viene infettata da un virus, il nostro sistema immunitario ha evoluto un meccanismo per riconoscere tali cellule e indurle a morire, per evitare di diffondere ulteriormente l’infezione; questo compito spetta ad una popolazione cellulare particolare: i Linfociti T citotossici, che devono il nome proprio alla funzione che svolgono (non sono gli unici in realtà ad esserne capaci, ma sono senza dubbio i più importanti, o come spesso accade in biologia soltanto i più studiati).
Nel secondo caso in qualsiasi tessuto sano, tranne in condizioni particolari, il numero di cellule è pressappoco costante, per un perfetto bilanciamento tra proliferazione e morte cellulare. Una mancata proliferazione od un’eccessiva morte cellulare porta ad ipoplasia, viceversa c’è iperplasia. I motivi per l’uno e l’altro scompenso possono avvenire sono diversi.
Nel terzo caso potremmo fare l’esempio dei neuroni; durante lo sviluppo del sistema nervoso, le cellule che si formano sono molte di più di quelle che poi effettivamente permangono. Sopravvivono soltanto quei neuroni che riescono a contattare con i loro assoni ed a essere contattati correttamente da altri neuroni/organi bersaglio (axon pathfinding). Gli altri vanno incontro a morte cellulare perchè non ricevono i segnali di sopravvivenza. Come spiegherò più approfonditamente dopo, i segnali di sopravvivenza sono fondamentali per una cellula. Questi segnali solitamente provengono dall’esterno della cellula stessa e la mantengono in vita. Se asportiamo la cellula dal suo contesto e non le diamo i fattori di crescita, la cellula muore. Le cellule tumorali sono in grado di iperstimolarsi e spesso, in condizioni di assenza di fattori di crescita, riescono comunque a sopravvivere.
Normalmente, il processo di morte cellulare programmata viene chiamato apoptosi, termine creato ad hoc dal 1972 da John Kerr (articolo originale). Il modello studiato era il nematode C elegans.
L’apoptosi è un processo irreversibile e preciso. L’evento cruciale è l’attivazione della “cascata delle caspasi”. Per cascata in biologia molecolare si intende una serie di attivazioni enzimatiche successive, solitamente partendo dall’attivazione di un recettore, che portano ad una risposta finale. Esistono numerosi esempi di queste cascate, le più studiate sono la cascata delle Ras-MAP chinasi e la cascata delle caspasi. Le caspasi sono una famiglia di proteasi (enzimi che idrolizzano il legame peptidico tra un amminoacido e il suo contiguo), che una volta attivate in cascata, tagliano e attivano tutta una serie di bersagli che portano alla degrazione ordinata del DNA, alla perdita dei legami con le cellule circostanti e alla frammentazione della cellula stessa in corpi apoptotici, che vengono successivamente fagocitati dai macrofagi.
Come potete vedere è un processo che non lascia nemmeno traccia.
L’attivazione delle caspasi può avvenire principalmente in tra modi: attraverso un cosiddetto recettore di morte, come il TNFR (recettore per il TNF) e FAS. Questi recettori sono espressi su praticamente tutti i tipi celluari, e una volta attivati dai loro rispettivi ligandi, innescano le caspasi (direttamente o indirettamente) e la cellula va incontro a morte.
Oppure attraverso un danno intracelluare irreversibile, durante il quale si attivano numerose proteine pro-apoptotiche, come Bad o Bax, che portano tra le altre cose al danneggiamento dei mitocondri, i quali vengono distrutti. La distruzione dei mitocondri porta alla liberazione nel citoplasma della proteina citocromo c, che assieme a apaf-1 e ad una caspasi (la caspasi 9) iniziano e attivano la cascata.
Il terzo modo con cui le caspasi possono essere attivate inizia con i Linfociti T citotossici che introducono nella cellula bersaglio un enzima (chiamato Granzima) che attiva a sua volta le caspasi. Il linfocita può anche agire attivando il recettore FAS espresso sulla cellula.
Gli stessi linfociti possono andare in contro a morte attraverso lo stesso meccanismo. Nel nostro organismo ci sono i cosiddetti siti immunologicamente protetti, che sono delle zone anatomiche, come cornee, testicoli e il feto (anche se non è una zona anatomica), che non vengono raggiunti dal nostro sistema immunitario per evitare possibili danni (soprattutto al feto, che verrebbe riconosciuto come un qualcosa di estraneo dall’organismo materno). Questo isolamento viene attuato attraverso l’uccisione attraverso il recettore FAS dei linfociti.

Se volete farvi un’idea di quanto sia complesso il meccanismo dell’apoptosi, e come lui molti altri meccanismi, date un’occhiata a questo schema:

www.cellsignal.com

L’apoptosi è senza dubbio un argomento affascinante. Numerosi tumori si sviluppano inibendo l’apoptosi con mutazioni nei geni oncosoppressori pro-apoptotici (per vedere cos’è un oncosoppressore potete rileggervi il mio vecchio post sui tumori).
Voglio ora approfondire l’argomento parlandovi di uno studio (Lum et al., Growth Factor Regulation of Autophagy and Cell Survival in the Absence of Apoptosis. Cell 2005) condotto su cellule in coltura private dei geni proapoptotici Bax e Bak. Queste cellule incapaci di attivare l’apoptosi sono state messe in coltura senza il loro principale fattore di crescita (interleuchina 3). Normalmente le cellule private dei loro fattori di crescita vanno in contro ad apoptosi entro 48 ore. Queste cellule però non possono attivare l’apoptosi e pertanto sopravvivono. Smettono di replicarsi e le loro dimensioni diminuiscono progressivamente. Il loro metabolismo si arresta quasi completamente  (la glicolisi si arresta, i mitocondri si arrestano), sulla membrana diminuiscono i recettori ed i trasportatori di nutrienti (l’unica proteina che non ha un declino è il recettore per l’interleuchina 3). Dopo circa 24 settimane il 95% delle cellule muore comunque, probabilmente si sfaldano e si distruggono completamente, ma non tramite apoptosi.
Cosa succede in queste 24 settimane? Come ultimo e disperato tentativo di sopravvivenza forzata, le cellule cominciano ad autodigerirsi per ricavare energia. Questo processo si chiama autofagocitosi, durante il quale organuli, proteine e altre componenti cellulari vengono digeriti. Questo spiega la diminuzione delle dimesioni delle cellule.
I ricercatori hanno provato ad inibire anche l’autofagocitosi, inattivando i geni chiave del processo, e le cellule in questo modo sono tutte morte dopo circa 96 ore.
Come ho già detto, non è l’apoptosi in questo caso ad entrare in azione, ma un altra via, sicuramente meno pulita e più pericolosa (qualora questa si verificasse in un organismo), che è chiama necrosi (con l’accento sulla e).

Spero di non essere stato noioso. Se avete domande, chiarimenti, critiche come sempre dico, fatele! Se volete avere notizie aggiuntive chiedete (e sperate che vi sappia rispondere). Ciò detto, vi saluto! Alla prossima

Nonostante il titolo, non dovreste lasciarvi ingannare oramai, perchè dovreste sapere dove vado a parare di solito. Questo non è un post di etologia, ma di biologia molecolare e genetica.
Fino a qualche anno da si riteneva che in un organismo le due metà del patrimonio genetico derivanti dai due genitori contribuissero egualmente, ma si è scoperto che non è così. Per un gruppo di geni fare parte della linea materna o paterna è di fondamentale importanza per la sua futura attività.
L’imprinting è un termine che comunque è stato mutuato dall’etologia e indica proprio questo aspetto: un piccolo insieme di geni sono espressi esclusivamente dalla linea materna o dalla linea paterna e mai dall’altra. Non è incredibile? Questo fenomeno non è casuale, nel senso che geni che hanno un imprinting materno (che sono cioè espressi soltanto dall’allele di derivazione materna) conservano lo stesso imprinting in tutti gli organismi della stessa specie e probabilmente anche nelle specie affini. Molti dei geni “imprinted” nell’uomo, ad esempio, hanno lo stesso imprinting anche nel topo! In generale il fenomeno dell’imprintig è abbastanza conservato in tutti i mammiferi, ma è stato osservato ovunque negli eucarioti.
Non so se riusciate a comprendere la portata del fenomeno. Come diavolo possono essere distinti i geni in base linea parentale di appartenenza? Come è possibile che sempre lo stesso allele venga espresso? Sembra ovvio che non può essere questione di diversità di sequenza, perchè gli alleli sono in teoria identici.
Quindi ci deve essere qualcos’altro all’origine di questo strano fenomeno che viene trasmesso di generazione in generazione. Ci deve essere un modo per marcare il DNA in modo da poter identificare i geni in questione e soprattutto questa marcatura deve essere trasmessa di generazione in generazione.
A questo punto devo introdurre un concetto abbastanza complicato e che se anche all’inizio sembrerà che non c’entri nulla con quanto ho appena detto, in realtà è un passaggio fondamentale.
Tutti conosciamo il codice genetico, ma pochi conoscono il codice epigenetico. Il termine epigenetica indica un insieme di fenomeni che in qualche modo “stanno sopra” la genetica. Cosa vuol dire stare sopra? Non che sia più importante, ma soltanto che mentre il codice genetico si basa sulle sequenze nucleotidiche, le quali codificano informazioni ben precise come ben sappiamo, il codice epigenetico è un codice che non si basa sulle sequenze ma su altri elementi che adesso in breve spiegherò.
Questi elementi possono essere a carico del DNA stesso, come la metilazione (aggiunta di un gruppo -CH3) su entrambi i filamenti delle citosine in contesto CG; oppure possono essere a carico di una famiglia di proteine che interagiscono direttamente e fisicamente con il DNA e influenzano in modo determinante la trascrizione ed altri processi: gli istoni.
Cerco di spiegarmi meglio; il codice epigenetico è una sorta di linguaggio (come il codice genetico) e porta informazioni ben precise e fondamentali per lo sviluppo e la corretta funzione di una cellula. Questo linguaggio è costituito da un “alafabeto” che consiste principalmente in metilazione delle citosine in 5-metil-citosina quando le C sono precedute e/o seguite da una G. Questa metilazione avviene su entrambi i filamenti ad opera di una famiglia di enzimi chiamati DNMT (DNA-metil-transferasi). La metilazione sembra una modificazione insignificante, ma in realtà influenza pesantemente la struttura e la funzione del DNA.Diverse proteine si legano alle sequenze metilate e fanno in modo che il DNA assuma una conformazione densa e compatta e pressochè inattiva (eterocromatina). La metilazione non è l’unico elemento epigenetico, ma è l’unico ad interessare direttamente il DNA. Le altre modificazioni interessano delle proteine che sono strettamente associate al DNA gli istoni. Gli istoni sono le proteine che più frequentemente troviamo associate al DNA, il quale si avvolge letteralmente sopra. A seconda di come sono modificati gli istoni, il DNA può essere rilassato e attivo, oppure compatto ed inattivo. Però cosa si intende per compatto e per rilassato? Il DNA è approssimativamente un filo, quando è ripiegato tante volte su se stesso ed associato molto strettamente agli istoni allora è compatto; quando si trova in questo stato il DNA è inattivo perchè le proteine che sono necessarie alla trascrizione non riescono a legarsi all DNA stesso. Se invece il DNA è lineare è attivo perchè non ci sono ostacoli alla trascrizione.
Concentriamoci sulla metilazione delle citosine. Questa è l’unica modificazione che viene trasmessa e mantenuta da una cellula all’altra durante la divisione, ed è la responsabile della memoria cellulare! Cosa vuol dire? Vi siete mai chiesti come faccia una cellula già differenziata rimanere tale dopo la divisione cellulare? Come fa una cellula a sapere da che cellula deriva? Ricordatevi che una cellula quando si divide, replica e condensa tutti i cromosomi e li divide equamente tra le cellule figlie; queste ultime, una volta separate, decondensano i cromosomi e pertanto potrebbero in teoria decondensare ed attivare anche regioni che normalmente non dovrebbero essere attive in una cellula di quel tipo e diventare altre cellule. Come fanno a sapere cosa attivare e cosa no? Ok, mi direte voi, dal contesto e dal tessuto in cui si trova (se si trova in mezzo a epatociti diventerà epatocita); non è errata come risposta, ma non è sufficiente. E’ la metilazione che guida la memoria cellulare. Regioni metilate ed inattive nella cellula madre, saranno tenute metilate anche nelle cellule figlie, ad opera delle DNMT. Una cellula replica il suo DNA in maniera semiconservativa, pertanto le due copie di DNA che si formano avranno un filamento “vecchio” della cellula madre ed il complementare è invece appena sintetizzato. Pertanto le cellule figlie avranno soltanto un filamento di DNA che continua ad essere metilato,  quello della madre, mentre il complementare no! le DNMT riconoscono lecitosine in contesto CG metilate solo su un filamento e le metilano anche nel filamento complementare, mantenendo così intantta la meoria cellulare. Interessante non è vero???
Ok, spero di non avervi confuso le idee con questa digressione. Spero non abbiate perso il punto principale, ovvero l’imprinting. Ci eravamo chiesti quale “marcatura” potesse essere in grado di differenziare un allele dall’altro e che fosse in grado di trasmettersi lungo le generazioni. Come avrete già capito, questa marcatura è proprio la metilazione delle citosine. A questo punto si apre un problema. E’ noto che durante lo sviluppo embrionale sono le cellule staminali embrionali che danno origine all’individuo. Le cellule staminali embrionali (CSE) sono dedifferenziate e possono dare origine a qualsiasi cellula. Questo è possibile perchè il DNA dello zigote non appena c’è stata la fecondazione va incontro ad un ampio riarrangiamento e viene praticamente “demetilato” per cancellare la memoria cellulare e dare origine alle CSE. A questo seguirà una ondata di metilazione “de novo” che permetterà alle cellule di differenziarsi man mano che procede lo sviluppo. Non si conoscono ancora bene i meccanismi di questa nuova ondata di metilazione, però sta di fatto che se le metilazioni originali vanno perdute, come si fa a ristabilire l’imprinting nel modo corretto? Questo è possibile perchè non tutte le metilazioni vanno perdute, e tra le metilazioni che rimangono, ci sono quelle che regolano l’imprinting e pertanto questo viene conservato durante le generazioni.
Ora che abbiamo capito la logica che ci sta dietro, vediamo come sono regolati questi “imprinted genes”.  E’ stato notato che c’è una regione di DNA che può anche essere condivisa da più geni che può essere metilata o non metilata. Questa regione che può anche essere molto lunga è chiamata ICR (imprinted control region). E’ questa regione che è differentemente marcata tra le due linee parentali. Se è metilata su una linea non è metilata nell’altra. Solitamente le regioni metilate sono inattive, quindi la ICR metilata sarà un segnale di silenziamento genico.  Il discorso è però più complicato, perchè esistono due tipi di ICRs, ma non mi sembra il caso di addentrarmi ulteriormente.. mi sembra di aver messo già troppa carne al fuoco.

Spero di essere stato chiaro e non confusionario. spero di aver reso l’idea di quello che volevo dire! Se avete domande ovviamente siete caldissimamente invitate a farle. Così pure se volete semplicemente commentare o criticare!