Nonostante il titolo, non dovreste lasciarvi ingannare oramai, perchè dovreste sapere dove vado a parare di solito. Questo non è un post di etologia, ma di biologia molecolare e genetica.
Fino a qualche anno da si riteneva che in un organismo le due metà del patrimonio genetico derivanti dai due genitori contribuissero egualmente, ma si è scoperto che non è così. Per un gruppo di geni fare parte della linea materna o paterna è di fondamentale importanza per la sua futura attività.
L’imprinting è un termine che comunque è stato mutuato dall’etologia e indica proprio questo aspetto: un piccolo insieme di geni sono espressi esclusivamente dalla linea materna o dalla linea paterna e mai dall’altra. Non è incredibile? Questo fenomeno non è casuale, nel senso che geni che hanno un imprinting materno (che sono cioè espressi soltanto dall’allele di derivazione materna) conservano lo stesso imprinting in tutti gli organismi della stessa specie e probabilmente anche nelle specie affini. Molti dei geni “imprinted” nell’uomo, ad esempio, hanno lo stesso imprinting anche nel topo! In generale il fenomeno dell’imprintig è abbastanza conservato in tutti i mammiferi, ma è stato osservato ovunque negli eucarioti.
Non so se riusciate a comprendere la portata del fenomeno. Come diavolo possono essere distinti i geni in base linea parentale di appartenenza? Come è possibile che sempre lo stesso allele venga espresso? Sembra ovvio che non può essere questione di diversità di sequenza, perchè gli alleli sono in teoria identici.
Quindi ci deve essere qualcos’altro all’origine di questo strano fenomeno che viene trasmesso di generazione in generazione. Ci deve essere un modo per marcare il DNA in modo da poter identificare i geni in questione e soprattutto questa marcatura deve essere trasmessa di generazione in generazione.
A questo punto devo introdurre un concetto abbastanza complicato e che se anche all’inizio sembrerà che non c’entri nulla con quanto ho appena detto, in realtà è un passaggio fondamentale.
Tutti conosciamo il codice genetico, ma pochi conoscono il codice epigenetico. Il termine epigenetica indica un insieme di fenomeni che in qualche modo “stanno sopra” la genetica. Cosa vuol dire stare sopra? Non che sia più importante, ma soltanto che mentre il codice genetico si basa sulle sequenze nucleotidiche, le quali codificano informazioni ben precise come ben sappiamo, il codice epigenetico è un codice che non si basa sulle sequenze ma su altri elementi che adesso in breve spiegherò.
Questi elementi possono essere a carico del DNA stesso, come la metilazione (aggiunta di un gruppo -CH3) su entrambi i filamenti delle citosine in contesto CG; oppure possono essere a carico di una famiglia di proteine che interagiscono direttamente e fisicamente con il DNA e influenzano in modo determinante la trascrizione ed altri processi: gli istoni.
Cerco di spiegarmi meglio; il codice epigenetico è una sorta di linguaggio (come il codice genetico) e porta informazioni ben precise e fondamentali per lo sviluppo e la corretta funzione di una cellula. Questo linguaggio è costituito da un “alafabeto” che consiste principalmente in metilazione delle citosine in 5-metil-citosina quando le C sono precedute e/o seguite da una G. Questa metilazione avviene su entrambi i filamenti ad opera di una famiglia di enzimi chiamati DNMT (DNA-metil-transferasi). La metilazione sembra una modificazione insignificante, ma in realtà influenza pesantemente la struttura e la funzione del DNA.Diverse proteine si legano alle sequenze metilate e fanno in modo che il DNA assuma una conformazione densa e compatta e pressochè inattiva (eterocromatina). La metilazione non è l’unico elemento epigenetico, ma è l’unico ad interessare direttamente il DNA. Le altre modificazioni interessano delle proteine che sono strettamente associate al DNA gli istoni. Gli istoni sono le proteine che più frequentemente troviamo associate al DNA, il quale si avvolge letteralmente sopra. A seconda di come sono modificati gli istoni, il DNA può essere rilassato e attivo, oppure compatto ed inattivo. Però cosa si intende per compatto e per rilassato? Il DNA è approssimativamente un filo, quando è ripiegato tante volte su se stesso ed associato molto strettamente agli istoni allora è compatto; quando si trova in questo stato il DNA è inattivo perchè le proteine che sono necessarie alla trascrizione non riescono a legarsi all DNA stesso. Se invece il DNA è lineare è attivo perchè non ci sono ostacoli alla trascrizione.
Concentriamoci sulla metilazione delle citosine. Questa è l’unica modificazione che viene trasmessa e mantenuta da una cellula all’altra durante la divisione, ed è la responsabile della memoria cellulare! Cosa vuol dire? Vi siete mai chiesti come faccia una cellula già differenziata rimanere tale dopo la divisione cellulare? Come fa una cellula a sapere da che cellula deriva? Ricordatevi che una cellula quando si divide, replica e condensa tutti i cromosomi e li divide equamente tra le cellule figlie; queste ultime, una volta separate, decondensano i cromosomi e pertanto potrebbero in teoria decondensare ed attivare anche regioni che normalmente non dovrebbero essere attive in una cellula di quel tipo e diventare altre cellule. Come fanno a sapere cosa attivare e cosa no? Ok, mi direte voi, dal contesto e dal tessuto in cui si trova (se si trova in mezzo a epatociti diventerà epatocita); non è errata come risposta, ma non è sufficiente. E’ la metilazione che guida la memoria cellulare. Regioni metilate ed inattive nella cellula madre, saranno tenute metilate anche nelle cellule figlie, ad opera delle DNMT. Una cellula replica il suo DNA in maniera semiconservativa, pertanto le due copie di DNA che si formano avranno un filamento “vecchio” della cellula madre ed il complementare è invece appena sintetizzato. Pertanto le cellule figlie avranno soltanto un filamento di DNA che continua ad essere metilato,  quello della madre, mentre il complementare no! le DNMT riconoscono lecitosine in contesto CG metilate solo su un filamento e le metilano anche nel filamento complementare, mantenendo così intantta la meoria cellulare. Interessante non è vero???
Ok, spero di non avervi confuso le idee con questa digressione. Spero non abbiate perso il punto principale, ovvero l’imprinting. Ci eravamo chiesti quale “marcatura” potesse essere in grado di differenziare un allele dall’altro e che fosse in grado di trasmettersi lungo le generazioni. Come avrete già capito, questa marcatura è proprio la metilazione delle citosine. A questo punto si apre un problema. E’ noto che durante lo sviluppo embrionale sono le cellule staminali embrionali che danno origine all’individuo. Le cellule staminali embrionali (CSE) sono dedifferenziate e possono dare origine a qualsiasi cellula. Questo è possibile perchè il DNA dello zigote non appena c’è stata la fecondazione va incontro ad un ampio riarrangiamento e viene praticamente “demetilato” per cancellare la memoria cellulare e dare origine alle CSE. A questo seguirà una ondata di metilazione “de novo” che permetterà alle cellule di differenziarsi man mano che procede lo sviluppo. Non si conoscono ancora bene i meccanismi di questa nuova ondata di metilazione, però sta di fatto che se le metilazioni originali vanno perdute, come si fa a ristabilire l’imprinting nel modo corretto? Questo è possibile perchè non tutte le metilazioni vanno perdute, e tra le metilazioni che rimangono, ci sono quelle che regolano l’imprinting e pertanto questo viene conservato durante le generazioni.
Ora che abbiamo capito la logica che ci sta dietro, vediamo come sono regolati questi “imprinted genes”.  E’ stato notato che c’è una regione di DNA che può anche essere condivisa da più geni che può essere metilata o non metilata. Questa regione che può anche essere molto lunga è chiamata ICR (imprinted control region). E’ questa regione che è differentemente marcata tra le due linee parentali. Se è metilata su una linea non è metilata nell’altra. Solitamente le regioni metilate sono inattive, quindi la ICR metilata sarà un segnale di silenziamento genico.  Il discorso è però più complicato, perchè esistono due tipi di ICRs, ma non mi sembra il caso di addentrarmi ulteriormente.. mi sembra di aver messo già troppa carne al fuoco.

Spero di essere stato chiaro e non confusionario. spero di aver reso l’idea di quello che volevo dire! Se avete domande ovviamente siete caldissimamente invitate a farle. Così pure se volete semplicemente commentare o criticare!

Sì.. lo so che sotto esami sarebbe meglio concentrarsi sullo studio, ma è più forte di me!

Il titolo di questo post è molto chiaro (o forse no?). Parliamo di materia oscura, ma non la materia oscura dell’universo.. di quella se ne occupano i fisici.. Ma parliamo della materia oscura del genoma. Interessante analogia. Questo, devo dirlo subito, non sarà un post in cui troverete spiegazioni, perchè spiegazioni al momento non ce ne sono, ma solo ipotesi. Questo post più che altro è fatto di domande.

Il genoma è una struttura molto complessa, il cui funzionamento non è del tutto chiaro. Direi anzi che sappiamo pochissimo su come funziona! Dai batteri fino a noi, il genoma ha subito un’evoluzione che l’ha portato, non solo ad ingrandirsi, ma anche ad incorporare sequenze dal significato per ora ignoto.

Qui trovate un elenco di alcuni organismi, dai lieviti fino a noi, ordinati secondo le dimensioni del genoma, espresse in megabasi Mb (1Mb= 10^6 basi).
Una tale differenza di dimesioni non è però linearmente proporzionale nè al numero di geni presenti, nè alla complessità dell’organismo.

E’ chiaro che c’è qualcosa che non va. Qualche calcolo che non torna.  Noi abbiamo circa 30 mila geni, un nematode 19000. un moscerino 13000. Per non parlare della densità genica. La densità genica del lievito è più di 40 volte la nostra.  Perchè questo? Perchè, come dicevo prima, il genoma nel corso dell’evoluzione ha acquisito moltissime sequenze non codificanti, dal significato ignoto, che fino a qualche anno fa veniva chiamato DNA spazzatura (Junk-DNA). Da cosa è composto questo DNA non codificante?

Sequenze regolatrici (promotori, enhancers), introni, sequenze altamente ripetute (satelliti, minisatelliti, microsatelliti), trasposoni (sequenze che si spostano all’interno del genoma), sequenze di origine virale e così via. Il tutto rende il DNA codificante appena l’1.5% di tutto il genoma!
Ci sono diverse teorie al riguardo. Secondo la teoria del gene egoista, questo sarebbe DNA parassita che sfrutta il DNA funzionante per propagarsi; secondo altri rappresenta un meccanismo di difesa: una mutazione ha molte più probabilità di generarsi in queste sequenze non codificanti, che nei geni.

Comunque si credeva che queste sequenze non solo non codificassero per proteine, ma che non venissero neppure trascritte. Del resto non aveva senso che fosse il contrario. La trascrizione è un meccanismo complessissimo, altamente regolato e soprattutto dispendioso dal punto di vista energetico. Non ha senso che vengano trascritte sequenze inutili.
Tuttavia, qualcosa ci deve essere sfuggito, perchè con le moderne tecniche di analisi del trascrittoma (tiling arrays, RNA-seq) si è scoperto proprio quello che non ci saremmo mai aspettati: molte sequenze di RNA si allineano perfettamente con sequenze genomiche non codificanti. Perchè mai, se è inutile, viene trascritto? Forse del tutto inutile non è. Forse abbiamo sbagliato noi, forse dovremmo evitare di chiamare inutile ogni cosa che non sappiamo cosa faccia.
E’ proprio questa la materia oscura a cui fa riferimento il titolo: sequenze di RNA trascritte non codificanti che aspettano ancora di essere classificate.
Ci sono delle ipotesi che tentano di inquadrare questo fenomeno, che ovviamente andranno verificate:

->Artefatti biologici: (per artefatto si intende comunemente errore) ovvero originano da una trascrizione non specifica e a bassa intensità del DNA, e siccome le il DNA non codificante è la maggior parte, la statistica la dice lunga.

->Geni non codificanti: Ci sono prove sperimentali che indicano che questa trascrizione inspiegata sia comunque in parte regolata, e questo suggerisce che i non-coding RNAs abbiano qualche funzione regolativa (del resto sono già noti alla comunità scientifica i micro-RNA e compagnia bella).

->Nuovi geni codificanti: Si ipotizza che ci possano essere dei geni ancora da scoprire e che questi vengano trascritti. Oppure possono essere degli pseudogeni che oramai hanno perso la loro funzione originaria.

Concludo con una nota. E’ normale che con le tecniche di analisi moderne e con il supporto della biologia computazionale le conoscenze che avevamo sul Genoma e sulla biologia in generale vangano stravolte. Semplicemente cambia il modo con cui vengono presi ed analizzati i dati e tutte le cose che prima davamo per certe ora vengono messe in discussione. In fondo tutti i dati che avevamo acquisito prima che le più moderne tecniche venissero messe a punto soffrivano di un grande difetto: il bias; tipico errore che si commette spesso quando si fanno esperimenti andando a cercare ciò che si vuole trovare, ignorando tutto il resto che magari non ci aspettiamo che ci sia e quindi non cerchiamo neppure. E’ normale che si trovassero solo trascritti di geni codificanti perchè non ci saremmo mai aspettati di trovare altro. Del resto le tecniche ancora non permettevano di fare altrimenti.

Se avete domande, suggerimenti, osservazioni critiche, insomma, se volete dire la vostra, non tiratevi indietro!

L’elettroforesi è una tecnica basilare non solo della biologia, ma anche della diagnostica in generale. Trova un sacco di applicazioni dovute alla sua versatilità. Le elettroforesi più comunemente utilizzate solo le elettroforesi su Gel e si basano sulla capacità delle molecole biologiche di migrare in un campo elettrico. Questa capacità è dovuta dal fatto che la macromolecola biologica possiede una carica elettrica totale, positiva o negativa, e quindi, se posta in un campo elettrico, migrerà verso l’elettrodo di carica opposta.  Questa capacità di far migrare una carica in un campo elettrico può essere sfruttata per separare  le nostre molecole in base al loro rapporto z/m dove z solitamente simboleggia la carica e m, ovviamente, la massa, (anche se, parlando di molecole, dovrebbe essere Mw: molecoular weight e misurarsi non in grammi ma in dalton, ma alla fine è il concetto ad interessarci).
Le molecole che di solito vengono separate in elettroforesi sono solitamente gli acidi nucleici (DNA, RNA) e le proteine. essendo due classi di molecole diverse, meritano attenzioni distinte. Ora passiamo ad illustrare la tecnica in generale.

Come facciamo a preparare un’elettroforesi? Abbiamo bisogno di un gel, un supporto, generalmente di plastica, in cui inserire il gel e in cui attaccare gli elettrodi, un generatore di voltaggio, e una soluzione tampone, che serve a formare il contatto elettrico tra gli elettrodi e il gel (in pratica favorisce il flusso delle cariche). Esistono due tipi di gel: i gel di agarosio e i gel di poliacrilammide; L’agarosio è un derivato polisaccaridico di alcuni tipi di alghe, mentre l’acrilammide, che è il monomero che costituisce, appunto, le molecole di poliacrilammide, è una neurotossina e pertanto, durante la preparazione, questo gel va trattato con attenzione. Sin da ora vi dico che, qualora trovaste la sigla AGE, questa sta per: Agarose Gel Electrophoresis, mentre la sigla PAGE sta per:PolyacrylAmide gel Electrophoresis.
L’ultrastruttura di questi gel è costituita da pori, i quali permettono la migrazione delle molecole. Le dimesioni dei pori sono controllabili dall’operatore in base alla percentuale di Agarosio e di Acrilammide. Più i pori sono larghi, più facilmente le molecole migreranno, più sono stretti, e più, ovviamente, incontraranno resistenza.
Quando si prepara il gel, solitamente lo si allestisce diluendo l’agar o l’acrilammide in un tampone a temperature elevate (di solito si utilizza un microonde) e pertanto, inizialmente, il gel sarà liquido. Soltanto quando si raffredderà assumerà la tipica consistenza gelatinosa. Durante il raffreddamento, si inserisce alla sommità del gel un pettine (non quello per i capelli, ma la struttura è simile), i cui dentelli formeranno, nel futuro gel, dei pozzetti dentro ai quali si inseriranno i campioni da far correre.

il gel così formato verrà inserito nel supporto di plastica, i campioni verranno caricati nei rispettivi pozzetti (questa è una operazione che è divertente quanto stressante da eseguire, perchè è piuttosto difficile vedere i pozzetti trasparenti su un gel trasparente anch’esso; è perciò piuttosto facile rompere i pozzetti, oppure non centrarli e quindi riversare il campione al di fuori. Ci vuole solo un po’ di manualità, e ricorrere a qualche trucco, come mettere uno striscio di carta colorata sotto al gel in modo da far risaltare i pozzetti). Si ricopre il gel di soluzione tampone, si attaccano gli elettrodi (facendo attenzione e non invertirli), si aziona il generatore di voltaggio (generalmente 80V per 30 minuti) e si attende. quindi si preleva il gel e si mettono in evidenza le bande così ottenute. Generalmente, uno dei classici metodi per mettere in evidenza il DNA si basa sull’utilizzo di agenti intercalanti come l’etidio bromuro o il propidio ioduro che se eccitati con UV sono fluorescenti. Siccome però questi sono agenti cancerogeni molto pericolosi, ora si utilizzano altri agenti (SYBR GREEN).. anche se noi in laboratorio abbiamo usato il bromuro di etidio, ma lasciamo perdere. Per quanto riguarda le proteine, invece, si utilizzano altri coloranti, come il blue comassie. Più o meno, ecco come si presenta il tutto:

legenda:

Well: pozzetto
Buffer: Tampone
SDS-PAGE: Elettroforesi in Gel di PoliacrilAmmide con Sodio Dodecil Solfato (vedremo dopo cos’è questo componente)

Quest’immagine mostra chiaramente come le molecole grandi corrano di meno nel gel rispetto a quelle piccole. in questo caso sono mostrate proteine.

Ora due considerazioni di carattere tecnico. La prima riguarda il fatto che, come potete vedere nella figura, i pozzetti con i campioni da far correre sono in alto, o comunque ad un marigine del gel. Questo significa che dovremo fare attenzione a come posizioneremo gli elettrodi per far sì che i campioni corrano verso basso e non verso alto. se ho del DNA, questo avrà carica negativa; tenderà a spostarsi verso l’elettrodo positivo (l’anodo), che andrà pozionato quindi dalla parte opposta dei pozzetti. se noi lo posizonassimo sullo stesso lato, non otterremo nessuna corsa perchè lo spazio è troppo breve.
La seconda riguarda invece la preparazione dei campioni per la corsa. Ho detto all’inizio che la corsa elettroforetica sarà influenzata dal rapporto z/m. Ma dobbiamo tener conto anche di un altro fattore, ovvero la forma del campione, dove per forma intendo la struttura. Come sappiamo, sia gli acidi nucleici che le proteine hanno delle conformzioni piuttosto complesse, queste influenzano significativamente la corsa di un campione. Pertanto spesso si aggiungono dei denaturanti in modo da standardizzare la situazione. In più va detto che poichè le proteine possono avere carica variabile (gli amminoacidi hanno cariche diverse) si utilizza durante la corsa un agente che oltre a denaturarle, conferisce loro una omogenea carica negativa, in modo che la corsa avvenga solo in base alla MW, questo agente è l’SDS (sodio dodecil solfato).

Alla fine, dopo tutta questa tiritera, avrete un risultato simile:

In questo gel sono presenti due set di campioni  separai (DNA), uno superiore e uno inferiore.

le due strisce laterali di sinistra, quella superioe e qualla inferiore sono costituite da campioni standard di Mw note. Facendo quindi un confronto con queste bande, si può risalire al peso molecolare dei nostri campioni. Per una determinazione più precisa è possibile ricorrere alla seguente formula:

Rf= (Distanza migrazione del campione)/(distanza migrazione del colorante)

l’Rf è la mobilità elettroforetica; la distanza di migrazione del campione è la distanza percorsa dalla banda specifica dal pozzetto. Mentre la distanza del colorante è la distanza percorsa dal fronte del colorante. C’è una correlazione lineare tra l’Rf e il LogMw; si costruisce quindi una retta di taratura tra l’Rf e il LogMW dei campioni noti. Calcolando poi l’Rf dei nostri campioni da determinare, è facile risalire (grazie all’equazione della retta trovata) alla massa molecolare.

Ora vediamo un po’ di applicazioni pratiche: immaginamo di aver appena eseguito una PCR (per vedere cos’è in brevis una PCR potetevi leggervi un mio vecchio Post), e di voler vedere se abbiamo amplificato il frammento di DNA corretto, e se ci sono rumori di fondo (ovvero frammenti di DNA che si sono amplificati pur non essendo specifici ai primer). Io so (o in teoria dovrei sapere) le dimensioni  e la massa del mio frammento di DNA amplificato, e posso pertanto prelevare un’aliquota del mio campione, fare una corsa elettroforetica su un gel e vedere se si evidenzia  su questo gel una banda corrispondente al peso molecolare noto. Se la banda è nitida avremo avuto una amplificazione specifica, se invece vedremo sbavature, avremo ottenuto un’amplificazione indesiderata. Questo potrebbe farci indurre a ripetere l’esperimento.
L’elettroforesi è anche usata per la determinazione delle proteine presenti nel plasma (anzi, per meglio dire, nel siero) come ad esempio le immunoglobuline, le albumine, ecc…
Alcune tecniche di sequenziamento del DNA si basano sull’unione della PCR con l’elettroforesi. Insomma, l’elettroforesi è uno strumento estremamente utile e anche piuttosto semplice che è oramai insostituibile.

vi do un link molto molto bello, con molte immagini che vi illustreranno meglio il concetto:

Scienze a scuola

Per ultima cosa, è mio dovere aggiungere che esistono ovviamente diversi altri tipi di elettroforesi, come L’elettroforesi bidimensionale, e l’elttroforesi in campo pulsato, e che questo che ho appena spiegato è quello di base.

Come sempre, se avete dubbi, curiosità, domande, obiezioni, io sono qui. Ciau!

Ok, rieccomi! So che aspettavate da tanto il mio ritorno. (certo certo, come no..). Allora, questo Post è dedicato ad un aspetto molto interessante della biologia molecolare di base, il clonaggio. Un clone è, come sapete, un organismo esattamente uguale ad un altro dal punto di vista genetico. Ora, per clonaggio io non intendevo quello che è stato fatto con la pecora Dolly (vi ricordate?), ma mi riferivo al clonaggio di singoli geni. Perché spesso per i ricercatori è molto utile avere grandi quantità di singoli geni, perché in questo modo è possibile sequenziarli o utilizzarli come sonde per studiarne l’espressione in tessuti o organismi. Oppure, per inciso, è anche possibile spezzettare il genoma di un organismo, clonare i singoli frammenti, e ottenere così le cosiddette librerie (library) nelle quali vengono conservati questi frammenti di DNA e utilizzati quando occorre; esistono diverse tipi di library, ma non è questo l’argomento del post.
Vi dicevo, appunto, clonaggio di geni. Per clonare un gene, ma è anche possibile clonare diversi geni contemporaneamente, possiamo sfruttare la potenza e l’efficienza di uno strumento di cui la natura già dispone, ovvero l’alta capacità replicativa dei microorganismi. Se noi, quindi, riusciamo ad inserire il gene di nostro interesse in un batterio od in un lievito e lo lasciamo replicare, otterremo molte copie del gene di partenza. Il problema è: come introduciamo questo gene? Alcuni microrganismi hanno la capacità di assumere DNA dall’ambiente esterno, ma è un processo raro e poco efficiente, senza contare che, se non si inserisce nel cromosoma batterico, non verrà tramandato alla progenie, rendendo il clonaggio impossibile. Vengono così utilizzati dei vettori (sempre delle molecole di DNA) in cui inizialmente si inserisce il gene di interesse, e secondariamente si fa in modo che questo vettore venga assunto dal microorganismo. Cosa cambia, direte voi, inserire il gene singolarmente dall’inserirlo come parte di una molecola di DNA più grande? Cambia eccome, e ora vediamo il perché.

Esistono diversi tipi di vettori, qui ci concentreremo sui più utilizzati, ovvero i plasmidi. Un plasmide è una molecola di DNA circolare extracromosomiale naturalmente presente all’interno di alcuni batteri. Può avere dimensioni variabili e solitamente non è indispensabile al batterio, ma è in grado comunque di dare alcune capacità aggiuntive come ad esempio la resistenza ad alcuni antibiotici, la capacità di metabolizzare substrati particolari ecc. Viene replicato ad ogni divisione cellulare grazie alla presenza di una sequenza, detta origine di replicazione, riconosciuta dalle DNA polimerasi batteriche. In questo modo il batterio si assicura che la sua progenie avrà lo stesso plasmide. Capite, vero, il significato evolutivo di questo processo?

I ricercatori sfruttano questo potente mezzo per clonare i geni di interesse. I plasmidi utilizzati di solito sono sintetici e hanno una struttura simile:

Come vedete, è una molecola circolare. Ma ha anche molte altre caratteristiche, fin più interessanti. Innanzitutto, come ogni buon plasmide che si rispetti, ha un’origine di replicazione, indicata come ori. Le frecce indicano la direzione del plasmide, ovviamente quella canonica 5’-3. La freccia nera è il sito multiplo di clonaggio (MCS) o polylinker. È una sequenza piena di siti di restrizione noti, ovvero siti in cui gli enzimi di restrizione tagliano specificamente il DNA. Questo è di cruciale importanza. Se noi vogliamo inserire un gene in questo plasmide, dobbiamo procedere al taglio dello stesso. Ma non un taglio a caso, assolutamente no! Deve essere un taglio specifico (uno e uno solo, altrimenti il plasmide non potrà più ricomporsi circolarmente). Inoltre le due estremità del plasmide libere, derivanti da questo taglio, non dovranno essere nette, come se fossero state tagliate da un paio di forbici (in gergo le estremità di questo tipo vengono chiamate Blunt, da non confondere col cantante!), ma sfalsate; per sfalsate significa che uno dei due filamenti del DNA sporge rispetto all’altro (è chiaro che se un estremità ha il filamento 5’-3’ sporgente, l’altra estremità avrà sporgente il filamento opposto), in modo che queste estremità possano riappaiarsi molto facilmente, vengono dette infatti sticky ends, ovvero appiccicose. Come mostrato in figura:

Ebbene Questo taglio ci serve per poter inserire nel plasmide il nostro gene di interesse. Quest’ultimo, a sua volta, dovrà avere le estremità adatte per poter legarsi al plasmide. Per ottenere questo si legano alle estremità del gene degli oligonucleotidi e li si taglia con lo stesso enzima di restrizione che si usa nel plasmide, in questo modo le estremità appiccicose sono complementari, e si potrà avere l’inserimento del gene nel plasmide. l’enzima di restrizione non deve però tagliare il gene in altri punti, ma solo alle estremità, per questo si deve fare molta attenzione agli enzimi di restrizione da usare (esistono dei programmi che individuano tutti i siti di restrizione presenti in una data sequenza, è meglio usarli per sapere se ci sono enzimi di restrizione che tagliano nel MCS ma non nel gene). Per far legare il gene con il plasmide, si utilizza un enzima chiamato Ligasi; la reazione si chiama di Ligazione.In teoria, voi direte, è finito qua; nel senso, noi inseriamo il gene nel plasmide, e non paghi di ciò inseriamo il plasmide ricombinante nei batteri(questo processo è chiamato trasformazione). Mettiamo i batteri a crescere, felici e contenti, su un terreno solido e otteniamo tantissime copie del nostro plasmide, e quindi del nostro gene. Già, peccato che c’è un piccolissimo ed insignificante dettaglio. Se facessimo solo così noi non avremmo la possibilità di distinguere i batteri che hanno assunto il plasmide da quelli che non l’hanno assunto (la trasformazione è un processo a resa piuttosto bassa), e per di più non riusciremmo a distinguere i batteri che hanno assunto il plasmide ricombinante da quelli che hanno assunto il plasmide senza il nostro gene (anche la ligazione non ha una resa del 100%, e alcuni plasmidi possono richiudersi su se stessi senza incorporare il gene). Come fare? Be, i ricercatori hanno risolto il problema molto elegantemente. Una delle cose più ammirevoli nella scienza è come gli scienziati riescano a trovare degli escamotage eleganti e raffinati per aggirare i problemi. Torniamo per un attimo a visionare la mappa del plasmide; vedete la frecciona indicata con ampicillin (Ampicillina in italiano)? L’Ampicillina è un antibiotico, quindi letale per i batteri; Bene, questo indica che nel plasmide è presente un gene (ampicillin, appunto) in grado di dare resistenza al batterio nei confronti di questo antibiotico. Questo gene viene detto marcatore di selezione, perché ci permette di distinguere i batteri che hanno assunto il plasmide, da quelli che non l’hanno fatto, perché i primi cresceranno anche i presenza dell’antibiotico, mentre i secondi no. Ok, benissimo, ma non basta; non possiamo ancora distinguere i batteri con il plasmide ricombinante da quelli con il plasmide originale (senza il gene). Qui il discorso si fa complesso, ma estremamente interessante. Ritorniamo a vedere la mappa del plasmide. Nel sito multiplo di clonaggio è indicato LacZ. Questo LacZ è un gene (uno dei responsabili della metabolizzazione del lattosio nei batteri) che codifica per un enzima, la B-galattosidasi. Se il plasmide ha ricombinato con il gene, quest’ultimo si è andato ad inserire nel bel mezzo del gene LacZ, inattivandolo (perché il gene, ricordiamolo, si inserisce all’interno del sito multiplo di clonaggio) Come facciamo però a verificare se questo è avvenuto o meno? Semplice, nel terreno di coltura dove i batteri vengono fatti crescere, oltre all’Ampicillina (in questo caso, ma esistono anche altri antibiotici verso i quali si può indurre una resistenza) aggiungiamo non il lattosio, bensì l’X-Gal. Questa molecola viene riconosciuta dalla B-galattosidasi e metabolizzata. Quando viene metabolizzato, l’X-Gal rilascia un gruppo cromogeno in grado di dare una colorazione blu. Quindi, ricapitoliamo: se il batterio cresce in presenza di antibiotico, vuol dire che ha assunto il plasmide. Se la colonia risultante sarà di colore Blu, vuol dire che il gene LacZ funziona ancora e che quindi il gene di interesse non è stato incorporato nel plasmide. Se invece cresce una colonia bianca, vuol dire che LacZ è stato inattivato dal gene di nostro interesse. Questo metodo viene detto selezione blu/bianco. Per essere precisi, oltre all’X-gal è necessario aggiungere ai batteri anche un’altra molecola, chiamata IPTG, in grado di favorire l’espressione del gene LacZ. Quindi, quando, dopo l’incubazione dei batteri (dopo la trasformazione), tiriamo fuori le piastre e diamo un’occhiata, potremo farci un’idea delle colonie ricombinanti da quelle non ricombinanti in base al loro colore, ricordo infatti che una colonia deriva da una singola cellula progenitrice, quindi siamo sicuri che tutte le cellule di una colonia sono uguali tra di loro.Questo è uno dei tanti metodi possibili. Probabilmente è il più famoso, o, se non lo fosse, è se non altro quello che ho usato in laboratorio, quindi quello che vi so spiegare con più sicurezza.Come dicevo, i plasmidi non sono gli unici vettori disponibili. Sono i più facili e più economici da usare, ma hanno lo “svantaggio” di avere una piccola capacità, nel senso che non sono stabili con inserti troppo grossi. Quindi, in caso volessimo clonare il genoma di un animale o di una pianta, risulterebbero un po’ scomodi. Ci sono altri vettori, più adatti a questo genere di esperimenti: i cosmidi, gli YAC e i BAC. Degni di nota sono anche i fagi, ovvero dei virus che possono essere usati come vettori. Forse mi occuperò di loro in prossimi post, oppure c’è sempre la mitica Wikipedia, anche se consiglio quella inglese.
Per curiosità, il laboratorio che ho fatto, prevedeva il clonaggio di un gene: l’angiopietina2 umana. Questo gene codifica per una proteina omonima che è stata associata (e da qui il nome) alla formazione di nuovi vasi sanguigni, pertanto estremamente importante nello sviluppo di alcuni tumori. Abbiamo usato come un ceppo di Escherichia coli come batteri. La mappa del plasmide utilizzato è quella che ho postato.

Come sempre, se avete domande, precisazioni, correzioni da fare, io sono qui! Ciaoooo!

Forse vi sarà capitato di intravedere (o di guardare con avido interesse) qualche episodio di serie poliziesche come Numb3rs (del quale credo che riparlerò ancora) o Law and Order nelle quali (in ogni puntata della prima e in qualcuna della seconda) si vedono mappe colorate appese alle pareti sulle quali vengono rappresentate con colori diversi le zone nelle quali ci sono diverse probabilità che risieda l’assassino.

La prima domanda che sorge spontanea è “si tratta di fantascienza? La risposta è semplicemente no.  Negli anni ‘80 l’agente canadese Kim Rossmo  che coltivava parallelamente al suo lavoro l’interesse per la matematica utilizzò le sue conoscenze in questa disciplina e le sue modellizzazioni come strumento di investigazione. Riesaminando vecchi casi di killer o stupratori seriali costruì una formula, detta appunto formula di Rossmo, che esaminerò in seguito,  la quale permette di associare, una volta inseriti i parametri del caso, ad ogni punto di una mappa la probabilità che tale punto sia una base (residenza, luogo di lavoro) del criminale (a patto chiaramente che si tratti di un criminale di tipo seriale). Qualche tempo dopo sfruttando tale formula Rossmo costruì un programma Rigel che costruiva le mappe del quale oggi il creatore di occupa, aggiornandolo e insegnandone il funzionamento.

La domanda sorge spontanea: funziona? Rossmo risolse con il metodo del profiling geografico qualche caso in Canada e divenne famosissimo per aver scoperto uno stupratore a Lafayette, in Lousiana, che per più di dieci anni aveva molestato molte donne della città.  Il caso, denominato South Side Rapist, creò molti problemi alla polizia locale che si rivolse a Rossmo che riuscì a circoscrivere la zona di residenza del malvivente, all’interno della quale venne prelevato il DNA di tutti gli uomini residenti (e dopo un primo buco nell’acqua anche agli ex-residenti) permettendo di identificare l’uomo.

Ci tengo a precisare che questo metodo funziona soltanto se adottato nei casi di killer seriali con una base fissa. Accadde infatti che si tentò di applicarlo al caso di un cecchino (si scoprì poi che erano due)  denominato Beltway Sniper che non aveva(no) una base fissa. Il risultato ovviamente fu un insuccesso.

Come mai? Su che cosa si basa il profiling geografico? Come suggerisce il nome, che ricorda il profiling psicologico, già utilizzato in criminologia, si tratta di definire quali aree urbane siano con più probabilità la sede del killer. Non si tratta pertanto di prevedere dove e come il criminale agirà , perchè questo è molto complicato: dipende da molte, troppe variabili, molte delle quali non sono note.  Kim Rossmo spiegò il funzionamento del suo metodo con un esempio (ripreso nella prima puntata della prima serie di Numb3rs) molto chiaro. Si immagini uno spruzzatore da giardino (di quelli che ruotano per esempio): è praticamente impossibile prevedere dove cadrà la prossima goccia perchè in gioco vi sono troppe variabili (velocità di rotazione dello spruzzatore, direzione e velocità del vento, eventuale presenza di ostacoli…). Tuttavia è possibile anche non vedendo la locazione dello spruzzatore data una serie di punti dove sono atterrate le gocce calcolarne la posizione. Il principio utilizzato è lo stesso con opportune variazioni: si tiene conto di alcune informazioni note dalla criminologia (ad esempio la tendenza dei seria killer a colpire vicino alla loro base, ma non troppo vicino salvaguardando una specia di zona franca) , del fatto che le sedi possono essere più di una e della naturale tendenza umana a creare schemi anche quando tenta di comportarsi in modo casuale.

Su quest’ultimo punto vorrei insistere particolarmente: sono stati fatti una serie di studi chiedendo a gruppi di volontari di scrivere numeri casuali su un foglio e parallelamente  ad altri volontari veniva chiesto di scegliere in numeri da scrivere tirando dei dadi. Ebbene nonostante gli sforzi dei primi si rivelò facilissimo distinguere gli elenchi veramente casuali. Questo perchè gli elenchi del primo gruppo non presentavano quasi mai la concentrazione di numeri vicini, cosa invece casualmente può accadere! Analogamente chiedendo a delle persone di disporsi in una stanza casualmente esse tenderanno a disporsi all’incirca tutti alla stessa distanza l’una dall’altra (non vale chiederlo dentro un’università di matematica).

Tutto questo è espresso dalla formula di Rossmo:

Formula di Rossmo

Si può osservare anzitutto che a sinistra dell’uguale troviamo la probabilità di un punto appartenente ad una mappa alle coordinate ij di essere una sede del killer (i e j si usano in generale in matematica come indici per rappresentare la riga e la colonna). A destra vi è una costante k moltiplicata per una sommatoria da 1 a c (che indica il numero dei casi noti): in altre parole si sommano tanti termini quanti sono i casi precedenti. Ogni termine è a sua volta composto da due termini: il primo presenta una distanza a denominatore elevata ad un f da noi scelto in base ai parametri del caso e a numeratore una funzione indicata con la lettera greca phi che rappresenta una funzione peso per dare più peso ad un termine (il primo o il secondo) o all’altro (il secondo o il primo rispettivamente). Questo termine rappresenta il decrescere della probabilità all’aumentare della distanza e può ricordare alcune leggi fisiche come la legge di gravitazione universale o la legge di Coulomb anche se in questo caso la potenza non è necessariamente f = 2. Il secondo termine può sembrare più strano: a denominatore si sottrae la distanza da una costante B (un altro parametro che va inserito a seconda del tipo di indagine) e a numeratore compare, sottratta però, di nuovo la funzione peso. Questo secondo termine rende conto della presenza della zona cuscinetto, le cui dimensioni sono rappresentate tramite il parametro B.

Si può osservare chiaramente quali siano le restrizioni legate all’utilizzo di questa formula e quanti parametri si debbano stimare per utilizzarla. Un discorso analogo si deve fare per il software Rigel. Tuttavia in molti casi si sono rivelati strumenti utili per aiutare le forze di polizia e piano piano stanno trovando anche altre applicazioni.

Per chi fosse interessato e volesse saperne di più posso consigliare di guardare la prima puntata di Numb3rs la cui vicenda è molto, ma molto simile a quella di Kim Rossmo, da cui è ispirata, e di fare una capatina su Numb3rs.Wolfram e su PopSci, oltre alla lettura di “Il matematico e il detective” di Keith Devlin e Gary Lorden. Consiglio inoltre di visitare il sito web del Center for Geospatial Intelligence and Investigation.

E’ vero, forse questo titolo porta fuori strada, ma intitolare questo post (dopo parecchio tempo di latitanza) semplicemente Uno sguardo all’effetto Cerenkov mi sembrava troppo scolastico. In ogni caso come il nome suggerisce questo titolo deriva dal fatto che il fenomeno su cui volevo fare quattro chiacchiere è stato scoperto da Pavel Cerenkov , fisico russo esperto di fisica nucleare che per la scoperta di questo effetto vinse anche il premio Nobel.

Ma di che cosa si tratta? Cerenkov osservò che se una carica in moto attraversava un mezzo (per esempio dell’acqua o del benzolo) ad alte velocità si diffondeva una inspiegabile  luce blu.

La spiegazione di questo fenomeno è piuttosto complessa, ma molto interessante in quanto coinvolge diversi settori della fisica. Il primo è la meccanica ondulatoria e si lega a questo fenomeno in quanto la luce ha un comportamento ondulatorio. Probabilmente avrete notato andando in barca (oppure semplicemente guardando una papera in uno stagno) il formarsi di una specie di triangolo nella scia che la barca lascia dietro di sè. Questo tuttavia accade soltanto a determinate velocità. La barca muovendosi sull’acqua ne perturba la superficie pertanto iniziano (se essa si muove piano) a formarsi in tutte le direzioni onde circolari (analoghe a quelle che potete vedere gettando un sassolino nell’acqua).

Queste onde si propagano ugualmente in tutte le direzioni e ciò si può facilmente vedere attraverso la loro forma circolare. Accade però che se la barca si muove con velocità superiore a quella di propagazione dell’onda osserveremo il formarsi di un triangolo nell’acqua caratterizzato, all’aumentare della velocità della barca da un un angolo detto angolo di Mach. Un fenomeno del tutto analogo si osserva con il suono, che ricordiamo è un’onda di pressione nell’aria, quando un aeroplano si muove più velocemente della velocità del suono.

In questo caso però le onde sono trimensionali nello spazio e generano un cono che si vede attraverso il vapore acqueo che si forma sui fronti d’onda dell’onda di pressione generata.

Ma tutto questo cosa c’entra con le particelle cariche? Nella nostra situazione l’aereo, la barca o la papera sono rappresentate da particelle cariche che si muovono in un mezzo (acqua, per esempio). Un particella carica all’interno di un mezzo dielettrico polarizza  il mezzo in cui si sta muovendo, vale a dire che deforma per ragioni elettriche la forma degli orbitali delle molecole che lo costituiscono, con la formazione di alcuni dipoli elementari. Per velocità minori di quella della luce in quel mezzo (attenzione la velocità della luce nel vuoto non è superabile, ma quella della luce in un mezzo sì!) tale perturbazione è simmetrica, perciò quando, passata la particella, i dipoli ritornano nel loro stato elementare emettendo energia le radiazioni elettromagnetiche emesse tendono a compensarsi dando come risultato un campo pressochè nullo.

Tuttavia se la particella carica è sufficientemente veloce questa simmetria viene meno (le onde non si propagano più uniformemente in tutte le direzioni per lo stesso motivo per cui si forma la scia dietro la barca) e la radiazione risultante diventa misurabile (e percettibile). Si tratta perlopiù di radiazione ultravioletta, ma anche di alcune componenti della luce visibile (quelle a frequenza più alta, per ragioni , suppongo, di tipo energetico).

Questo fenomeno oltre ad essere interessante si rivela anche molto utile. Infatti questo effetto viene sfruttato dai rivelatori Cerenkov per i neutrini (particelle che interagiscono pochissimo con la materia) che vengono osservati nei raggi cosmici (ad esempio nel rivelatore giapponese Super-Kamiokande, un enorme vasca di acqua purissima circondata da fotomoltiplicatori, gradevole anche dal punto di vista estetico), oppure nei telescopi a raggi gamma, come MAGIC , oppure ancora per la misurazione delle velocità di particelle cariche.

L’argomento è molto interessante e suggerisco a tutti di guardare il documentario dedicato ad esso su Youtube (con le animazioni infatti sarà sicuramente più chiaro di come ho spiegato qui). Invito come sempre tutti ad esprimere commenti, perplessità e correzioni!

Le immagini in questo post sono state tratte da Wikipedia e sono senza Copyright.

Le proteine sono una delle quattro famiglie di macromolecole fondamentali per il nostro organismo, assieme ai carboidrati, ai lipidi e agli acidi nucleici (DNA e RNA). Una buona parte della biochimica è rivolta allo studio delle proteine che svolgono una quantità di funzioni immensa.
Le proteine sono macromolecole costituite da una sequenza definita di L-amminoacidi, legati uno all’altro con un legame carbamidico (o peptidico). Una volta sintetizzate, le proteine assumono una struttura tridimensionale specifica (attraverso un processo di folding, alias ripiegamento), perchè la loro funzione è intimamente associata alla loro struttura, se la struttura è difettosa, risulterà tale anche la funzione, numerose malattie sono dovute ad un errato ripiegamento delle proteine (anemia falciforme, BSE, ecc..).
Esistono diversi gradi di struttura per una proteina; la semplice sequenza lineare degli amminoacidi è detta struttura primaria; non discuterò qui la struttura e la geometria del legame peptidico, basti sapere che è un legame estremamente rigido che non permette la rotazione, ruotano però i due legami contigui ad esso il Cα-COOH e il NH-Cα e dalla rotazione di questi legami vengono formati due angoli, rispettivamente Ψ (Psi) e Φ (phi); questi due angoli teoricamente possono variare da -180° a + 180°, anche se in pratica alcuni di questi valori sono proibiti per delle interferenze che si possono venire a creare tra le catene laterali degli amminoacidi. I valori ammessi di questi angoli possono venire riportati su un grafico in cui un psi viene studiato al in funzione di phi, questo grafico è detto grafico di Ramachandran (Ramachandran’s plot).
In Base agli amminoacidi e agli angoli il polipeptide (la sequenza di diversi amminoacidi) può assumere conformazioni più complesse, che vengono definite strutture secondarie. Le più comuni strutture secondarie sono α-elica e il β-foglietto (oβ-sheet):

-α elica: è un’elica destrorsa formata dall’avvolgimento attorno ad un asse centrale immaginario del polipeptide. In questa elica le catene laterali degli amminoacidi sono proiettate all’esterno. L’alfa Elica ha un’unità ripetitiva di 5.4 angstrom, ed è stabilizzata al suo interno da interazioni non covalenti; anche se non è l’unica struttura elicoidale esistente nel mondo proteico, l’alfa elica è senz’altro la più comune. E’ molto frequente nelle proteine fibrose come la cheratina o il collagene.

- β-foglietto: è una struttura più estesa e si forma quando due o più segmenti del polipetide si trovano ad essere paralleli (non dovete però immaginarli staccati, ma in continuità…un oggetto che ci si avvicina è una serpentina). nel Beta foglietto ogni segmento che lo compone ha un andamento a zig-zag e le catene laterali sono alternativamente proiettate al di sopra e al di sotto del piano formato dal foglietto. La struttura è stabilizzata da legami non covalenti al proprio interno. Possono esserci due tipi di β-foglietto: parallelo o antiparallelo a seconda della direzionalità dei segmenti che lo compongono. Generalmente l’antiparallelo è più stabile.

Sono poi stati studiati dei segmenti all’interno della struttura proteica che collegano le estremità di due segmenti o in conformazione  alfa o in conformazione beta, e sono chiamati ripiegamenti beta o β-turns.
Poichè abbiamo detto che a seconda degli amminoacidi presenti possiamo avere o una o l’altra conformazione, in un polipeptide sufficientemente lungo e vario nella sequenza potremmo avere, e difatti abbiamo, regioni con una conformazione e regioni con un’altra. Un ulteriore ripiegamento nello spazio
del polipeptide con queste conformazioni secondarie porta ad una conformazione tridimensionale (struttura terziaria) in cui diverse regioni, magari prima anche distanti, interagiscono tra di loro per dare una struttura compatta e funzionale alla proteina. Se la proteina in questione è un enzima verrà formato il sito attivo funzionale e specifico, e, se è previsto, anche la tasca dove si inserirà il cofattore; se invece è un recettore si formerà il sito di legame con il ligando etc. In base al tipo di ripiegamento vengono distinte proteinde fibrose e proteine globulari; le prime, come collagene e cheratina, hanno una struttura adatta a ricoprire ruoli strutturali, mentre le seconde, come le globuline, hanno una struttura più globosa e compatta delle prime e di solito non hanno ruoli strutturali.
Se immaginiamo di avere diverse catene polipeptidiche legate non covalentemente, ognuna con la sua struttura e il suo ripiegamento, abbiamo una struttura quaternaria. Alcune proteine infatti sono formate da più subunità polipeptidiche associate non covalentemente, e le interazioni tra le varie parti possono influenzare le proprietà e le funzioni della proteina. L’esempio più famoso che mi viene in mente è l’emoglobina, la proteina responsabile del trasporto di ossigeno negli eritrociti. Essa è costituita da quattro subunità, a due a due identiche: 2 α e 2 β (non c’entra con l’α-elica e il β-foglietto..) per un totale di 64500Dalton; ciascuna di queste subunità contiene in appositi siti un gruppo eme, una molecola non proteica responsabile del legame e del trasporto dell’ossigeno.
Torno a sottolineare l’importanza di un corretto ripegamento tridimensionale per la proteina, perchè se questo è errato o viene successivamente perso viene a determinarsi  anche la perdita della funzione. Supponiamo ora di avere una proteina di piccole dimensioni, circa 100 amminoacidi, e supponiamo che ciascun amminoacido abbia in media la possibilità di trovarsi in 10 conformazioni diverse: la proteina avrà qualcosa come 10 alla centesima diverse possibili conformazioni. Anche ammettendo che la proteina ne provi casualmente ciascuna in 10^-13 secondi, per esplorarle tutte ci impiegherebbe circa 10^77 anni…e dato che l’universo ha circa 14 miliardi di anni, è impossibile che le proteine trovino casualmente la loro conformazione nativa. Questo problema prende il nome di paradosso di Levinthal.
I processi di ripiegamento non sono ancora completamente noti, ma ci sono delle teorie plausibili; una di queste prevede che i vari amminoacidi, guidati dalle interazioni, idrofobiche, polari o steriche, tra le loro catene laterali, si dispongano localmente ad alfa elica o a foglietto beta, questo cambia la conformazione del polipeptide e porta regioni prima lontane ad interagire e ad assumere nuove conformazioni, fino al completamento della struttura.
Cosa spinge però la proteina a ripiegarsi? è un processo spontaneo oppure dato da un dispendio di Energia? La risposta non è univoca, perchè alcune proteine si ripegano spontaneamente grazie alle interazioni degli amminoacidi tra di loro e con l’ambiente esterno, pertanto gli amminoacidi idrofobici verranno automaticamente posizionati il più lontano possibile dall’acqua (abbondante nel mezzo esterno), mentre verranno allontanati quelli con cariche dello stesso segno. Altre proteine hanno un ripegamento “guidato” e “assistito” da altre proteine, dette chaperonine (leggere “Sciaperonine”, perchè deriva da un termine francese), che utilizzano ATP per svolgere le loro funzioni.

Dopo così tanti post di matematica, fisica e affini è giusto far rilassare il lettore con un post sulla Biologia!

PCR è un acronimo che sta per Polymerase Chain Reaction, che per un italiano suonerebbe come reazione a catena della polimerasi. Ideata nel 1983 da un tale chiamato Kary Mullis, e questa scoperta gli è valsa il premio Nobel nel 1993, la PCR è una pratica che oramai è onnipresente negli studi concernenti la biologia, sia perchè è importantissima sia perchè è facilmente utilizzabile (tant’è che l’ho fatta anch’io nel laboratorio di biologia molecolare).
La PCR è utilizzata per amplificare ed isolare in maniera esponenziale dei segmenti di DNA in vitro, senza l’utilizzo di cellule batteriche.

Poichè in questa società CSI è tanto alla moda, non posso non evidenziare i risvolti polizieschi della PCR, poichè anche solo da una minuscola materiale biologico è possibile amplificare in maniera titanica il DNA, in modo da poterlo analizzare.
Per passare a risvolti più propriamente biologici, è molto importante nello studio della genetica:
sto facendo uno studio di genetica di popolazione, voglio vedere le differenze che intercorrono tra due popolazioni distinte della stessa specie, magari isolate tra di loro, cosa faccio? Semplice, analizzo alcune sequenze genomiche attraverso la PCR, così vedo se magari è in corso un fenomeno di speciazione.  E’ necessario analizzare sequenze genomiche sufficientemente polimorfiche per individuare le differenze; se invece voglio analizzare le parentele tra due specie differenti allora vado a studiare dei segmenti genomici più conservati, per vedere il grado di differenziazione, di solito si utilizzano i geni dell’RNA ribosomiale, che possiedono sequenze altamente conservate e sequenze molto polimorfiche. Non solo, la PCR è utilissima nell’analisi e nello studio delle malattie genetiche (Anemia falciforme, distrofia muscolare, ecc..).

Innanzitutto occorrono alcune informazioni preliminari sulla struttura del DNA. La struttura del DNA (scoperta da Watson (sì, quello che disse poco tempo fa che i neri sono meno intelligenti dei bianchi) e Crick, i quali a loro volta si sono basati su degli esperimenti fatti da Rosalind Franklin) è a doppio filamento, i quali si avvolgono in una doppia elica destrorsa. Un filamento di DNA è costituito dalla ripetizione di nucleotidi; un nucleotide è costituito da uno zucchero a 5 atomi di carbonio, il desossiribosio. Al carbonio 1 dello zucchero (chiamato 1′, si legge uno primo) si lega una base azotata (A, T, C, G) che costituisce la sola parte variabile del nucleotide, al carbonio 5′ (cinque primo) si lega un gruppo fosfato (che conferisce tra l’altro l’acidità al DNA) . Queste unità per formare un filamento si uniscono in modo che il fosfato in 5′ reagisca con il carbonio 3′ dello zucchero precedente. Quindi un filamento di DNA è formato da una successione di nucleotidi. A sua volta un filamento si accoppia ad un altro filamento per specifico appaiamento di basi: A con T e C con G (anche se non si formano legami covalenti ma solo ponti idrogeno). Ne risulta che un filamento è complementare all’altro, e data la sequenza di un filamento si può facilmente risalire alla sequenza del secondo.

Esempio: pATCGTTCTACTAAA il complementare sarà pTTTAGTAGAACGAT

Scritti così, con le informazioni che finora abbiamo non coincidono, ma non sono sbagliati; per capirlo devo però introdurre un’altra caratteristica del DNA, ovvero che i due filamenti sono detti ANTIPARALLELI ovvero che ciascun filamento è dotato di due estremità, un’estremità è quella che corrisponde al carbonio 5′ dello zucchero del primo nucleotide (a cui è legato il gruppo fofato libero, ecco perche nelle due sequenze c’è il p iniziale, indica il fosfato libero) e l’altra quella che corrisponde al carbonio 3′ dell’ultimo nucleotide. All’estremità 5′ di un filamento corrisponde l’estremità 3′ del filamento complementare, viceversa per l’estremità 3′ del filamento corrisponde la 5′ dell’altro: per convenzione un filamento singolo si rappresenta con direzionalità 5′–>3′, e così ho fatto per i due filamenti soprascritti, se ne tenete uno fermo e l’altro lo leggete al contrario sono complementari!
La PCR si basa sull’amplificazione per duplicazione dei filamenti di DNA; la tecnica ovviamente si svolge in vitro: noi abbiamo una provettina dentro la quale, tra le varie cose, inseriamo del DNA al cui interno sappiamo esserci la sequenza che vogliamo amplificare, un enzima capace di duplicare il DNA, chiamato DNA polimerasi (viene preferita una polimerasi termostabile, perchè nella tecnica viene variata la temperatura, estratta da un batterio termofilo: Thermus aquaticus), tutti e quattro i nucleotidi per dare alla polimerasi il materiale per funzionare, degli ioni per far funzionare meglio l’enzima, e poi delle sequenze singole di DNA di circa 20 nucleotidi chiamate primer. Questi primer sono complementari alle estremità 3′ della regione del DNA di interesse, questo perchè la polimerasi per ingranare ha bisogno di un innesco al quale aggiungere sequenzialmente i nucleotidi per la duplicazione. Perchè devono essere complementari all’estremità 3′ del DNA da duplicare? Perchè la polimerasi sintetizza un filamento di DNA in direzione 5′–>3′, pertanto il filamento da duplicare è visto in direzione 3′–>5′. Ora vediamo i singoli passaggi, abbiamo la provetta al completo.

1) alziamo la temperatura a 95°C per far separare i due filamenti del DNA
2) la abbassiamo successivamente a 60°C per permettere ai primer di appaiarsi ciascuno al proprio filamento complementare
3) Viene rialzata a 72°C per far funzionare la polimerasi la quale aggiunge nucleotidi ai primers in direzione 5′–>3′, copiando in questo modo il DNA d’interesse formando nuovi filamenti complementari

Si ripete per diverse volte questo ciclo fino ad amplificare ed isolare i segmenti di interesse!
Qui sotto è mostrato lo schema (lo so, l’ho fatto a mano e lascia a desiderare)

Schema grossolano della PCR

Se doveste notare errori, se voleste fare delle domande o delle precisazioni, scrivete pure nei commenti, altrimenti potete solo anche dire se vi è piaciuto oppure vi ha fatto schifo, sono accette tutte le critiche!

Chiedo venia per aver latitato per così tanto, ma ho avuto e ho tuttora molti impegni. Tuttavia credo che un po’ di tempo me lo possa pure concedere, di tanto in tanto.

Dunque, vorrei scrivere qualcosa sul fenomeno noto a tutti come rigetto. Seguendo il corso di immunologia, ho scoperto tante di quelle cose che prima mi erano terribilmente ignote,  e poiché le trovo straordinariamente interessanti, ho deciso di scrivere questo pezzo.Per rigetto si intende quel tipico fenomeno che, dopo un trapianto o trasfusione, fa sì che l’organismo del ricevente distrugga l’organo o il tessuto trapiantato, innescando contro di esso una risposta immunitaria.

I primi studi sul rigetto vennero effettuati all’inizio degli anni 40 dello scorso secolo, utilizzando topi da laboratorio. Se il trapianto veniva effettuato tra topi singenici (geneticamente identici) normalmente non si verificava il rigetto, se i topi erano allogenici allora era molto probabile che il rigetto avvenisse.  Dopo diverso tempo, si scoprì che gli esseri umani, e i vertebrati in generale, erano in possesso di una famiglia di geni particolari che fu denominata “Complesso maggiore di istocompatibilità o MHC” localizzata nel cromosoma 6 nell’uomo e sul cromosoma 17 nel topo; Questa famiglia si divide in MHC di classe I e MHC di classe L’MHC I viene espresso nella stragrande maggioranza delle cellule nucleate del nostro organismo, mentre l’MHC II viene espresso più ristrettamente nei macrofagi (cellule fagocitiche in generale) e nei linfociti B.

A cosa dà origine questa espressione? Dà origine a dei complessi proteici transmembranali che hanno il compito di presentare gli antigeni (esclusivamente proteici) rispettivamente ai linfociti T citotossici e ai linfociti T helper. Questi linfociti, infatti, sono responsabili (assieme ai Linfociti B) della risposta immunitaria specifica del nostro organismo contro uno specifico antigene. Per innescare questa risposta immunitaria, i linfociti T hanno bisogno che qualcuno presenti loro quest’antigene, solo in questo modo possono attivarsi e dare inizio alla risposta. In particolare l’MHC I, espresso sulle cellule nucleate, presenta antigeni proteici intracellulari, provenienti cioè dall’interno della cellula stessa, ai linfociti T citotossici, mentre l’MHC II presenta antigeni extracellulari che sono stati fagocitati o endocitati ai linfociti T Helper.
Quello che deve essere chiaro è che le cellule che presentano l’antigene ai linfociti T per il 90% presentano antigeni proteici del self, ovvero dell’organismo stesso, contro i quali non si deve sviluppare risposta immunitaria, e per un eventuale 10% presentano antigeni del non self ovvero estranei, contro i quali si deve attivare la risposta immunitaria. E’ compito esclusivo dei linfociti T discriminare il self dal non self, e attivarsi solo in quest’ultimo caso. Pertanto, la sola combinazione che innesca la risposta immunitaria dovrebbe essere questa:

MHC self + antigene non self = risposta immunitaria

Adesso dobbiamo fare diverse precisazioni, quest’equazione così com’è giustifica soltanto la risposta immunitaria attivata dai linfociti T Helper, ma non quella dei linfociti T citotossici, perché se i linfociti T citotossici sono attivati da MHC I self + antigene non self, è chiaro che l’MHC I presente sulle cellule del tessuto trapiantato è un MHC I non self (è espresso da cellule del tessuto trapiantato, pertanto non appartenenti all’organismo!); non è così per i linfociti T helper, ricordo che questi linfociti sono attivati da antigeni non self presentati da cellule fagocitiche e linfociti B self, pertanto è probabile che queste cellule penetrino nel tessuto trapiantato e qui fagocitino o riconoscano antigeni proteici delle cellule estranee, e successivamente presentino questi antigeni ai linfociti T H. Fino a qui non fa una piega.
Tuttavia delle volte anche i linfociti T citotossici possono essere attivati. Come è possibile? E’ possibile perché può capitare che gli MHC non self delle cellule estranee vengano riconosciute comunque dai linfociti T del ricevente. I riconoscimenti avvengono tramite sequenze amminoacidiche specifiche, ed è possibile che ci siano sequenze simili al punto tale da permettere questa confusione.

Mi rendo conto che è un argomento piuttosto complicato se non si hanno alcune basi, pertanto se aveste mai dei dubbi potete fare tutte le domande che volete nei commenti, e sperare che io sappia rispondere XD

Caronte

Questo intervento riguarderà l’assorbimento ed il trasporto di acqua e soluti attraverso la pianta.

Le piante sono costituite da una parte ipogea, che sta sotto terra, ovvero le radici ed una parte epigea, che sta all’aperto, fuori dalla terra, ovvero fusto e foglie. L’apparato radicale ha il compito di assorbire l’acqua e i sali minerali necessari alla pianta e grazie alla presenza di uno speciale tessuto conduttore, lo xilema, vengono trasportati a tutta la pianta. Come avviene questo assorbimento, e come lo spostamento? Dobbiamo innanzitutto sapere che l’acqua e le soluzioni acquose possono essere descritte in base al potenziale idrico (potenziale chimico dell’acqua)

Ψw = ψ_s + ψ_g + ψ_p

Il potenziale idrico viene definito come l’energia libera associata all’acqua (l’energia libera è l’energia potenziale utile per compiere un lavoro ed è importante sapere che è sempre definito come differenza tra l’acqua in un determinato stato e l’acqua in condizioni standard) ed è definito da tre variabili:

ψ_s: è la componente riguardante i soluti; i soluti abbassano l’energia libera dell’acqua.

Ψ_g: è la componente riguardante la gravità, dipende dalla differenza di altezza, dalla densità dell’acqua e dall’accelerazione di gravità

ψ_p: è la componente della pressione idrostatica

L’acqua tende a muoversi spontaneamente da zone a potenziale idrico più alto, verso zone a potenziale idrico più basso. Se si volesse farla muovere contrariamente, occorrerebbe un input di energia.
Bene, dopo questa tiritera, è giusto far notare che nel suolo è presente una quantità d’acqua variabile, e quest’acqua generalmente contiene una bassa concentrazione di soluti, ha quindi lo ψ_s prossimo allo zero, e il suo ψ_p varia a seconda della quantità d’acqua del suolo, più acqua ci sarà tanto più lo ψ_p sarà alto, al contrario sarà basso se ci sarà meno acqua. Questo fatto è espresso dall’equazione ψ_p= -2T/r dove T è la tensione superficiale dell’acqua, e r è il raggio delle curvature, delle “pieghe” (chiamate menischi) che la pellicola d’acqua presente nel terreno forma aderendo con le particelle dello stesso. Se c’è poca acqua, le curvature diminuiranno di dimensione, e la pressione idrostatica diminuirà, assumerà valori sempre più negativi. Questo farà diminuire complessivamente il potenziale idrico. Ebbene, quando le radici assorbono acqua, il potenziale idrico nel terreno circostante la radice diminuisce, e questo genera un gradiente di potenziale nei confronti delle zone adiacenti con lo Ψw maggiore. L’acqua pertanto fluirà spontaneamente verso la radice, che di solito ha un potenziale idrico ancora minore, la quale l’assorbirà; l’acqua all’interno della radice, si può muovere con diverse vie, o passando dal citoplasma di una una cellula a quello di un’altra (via simplastica) o passando tra una cellula e l’altra, attraverso le pareti cellulari (via apoplastica); esiste una via intermedia, detta via transmembrana, che vede l’acqua entrare in una cellula, riuscire ed entrare in quella successiva. Tutti questi spostamenti sono possibili grazie a proteine di membrana che permettono lo spostamento. In un modo o nell’altro, l’acqua giunge allo xilema, composto da cellule cave (hanno solo una parete cellulare ispessita, ma sono prive di citosol) che formano un sistema di tubi, sempre seguendo il gradiente di potenziale idrico (nello xilema lo Ψw è basso, questo richiama quindi acqua.)

lo xilema percorre tutta la lunghezza della pianta, perché l’acqua deve essere trasportata ovunque. Come viene spinta fino in cima? Le piante possono essere alte decine di metri, come fa l’acqua ad essere trasportata fin lassù? Possiamo escludere il trasporto attivo, quello cioè che avviene con dispendio di ATP, sarebbe troppo costoso, e la natura quando può economizza. Ebbene, l’acqua segue sempre il gradiente di pressione. Nelle foglie, infatti, lo xilema si ramifica per raggiungere ogni singola cellula. Le cellule del mesofillo, che è il tessuto fotosintetico della foglia, sono rivestite da una pellicola d’acqua che aderisce alle pareti cellulari cellulosiche. Grazie alla traspirazione, ovvero alla perdita di acqua delle foglie per evaporazione (solo se gli stomi sono aperti), si genera un ψ_p piuttosto negativo come avviene nel terreno (vedi sopra); questo genera una differenza di pressione tra lo xilema radicale e quello fogliare, generando un flusso d’acqua dalle radici alle foglie.

Se notate degli errori, incongruenze, se avete precisazioni se volete spiegazioni (per quanto io non sia un luminare), non esitate ad esprimervi!

M. C. (Caronte)