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Vettori retrovirali: come e perchè

15 novembre 2011 in lente di barlow by Manuel | 2 comments

Ammetto che i retrovirus turbano la mia mente, come biologo molecolare mi sento profondamente attratto da loro (patogeni esclusi), basta vedere quanta attenzione ho loro dedicato! Sarà che ben l’8% del mio genoma in realtà è retrovirale? Ma se è per questo anche il vostro (vedere articolo precedente)!
Un vettore molecolare è un sistema per trasferire elementi genici (geni interi, frammenti di geni, elementi regolatori) in un sistema accettore compatibile. Gli esempi di vettori più semplici che abbiamo sono i plasmidi batterici, molecole di DNA circolare (che si trovano normalmente in natura come elementi extracromosomici nei batteri, appunto) all’interno delle quali possiamo inserire dei geni di nostro interesse, dopodichè non dobbiamo “far altro” che introdurre questi plasmidi “pieni” all’interno dei batteri scelti (processo detto trasformazione) e in questo modo i batteri, che faremo proliferare, produrranno numerose copie di questo plasmide e se è il caso esprimeranno anche la proteina relativa (per approfondire leggere il mio vecchio articolo cloning a gene)!
I vettori retrovirali hanno la stessa filosofia di base, ma sono decisamente più sofisticati e raffinati. Ma andiamo con ordine! Ovviamente un vettore retrovirale si basa sulla biologia dei Retrovirus di cui, come ho già detto nell’articolo precedente, ho già parlato anche fin troppo (Qui e Qui e Qui), per cui non sto a rispiegare cosa sono e cosa fanno.

Quello che spiegherò invece è la struttura del genoma retrovirale; un retrovirus ha un genoma a RNA a singolo filamento. Alle estremità di questo filamento ci sono due sequenze terminali diverse, una sequenza terminale 5′ costituita da una regione chiamata R e una regione chiamata U5, e una sequenza terminale 3′, costituita da una sequenza chiamata U3 e una copia identica della sequenza R.

R-U5_________________(RNA a singolo filamento)_______________U3-R

Queste sequenze (R-U5 e U3-R) sono estremamente importanti sia nell’integrazione del genoma virale (retrotrascritto poi in DNA), sia nell’espressione dei geni virali da parte di fattori di trascrizione dell’ospite. Durante la retrotrascrizione, il processo col quale il Genoma virale di RNA a singolo filamento viene trasformato in un genoma a DNA a doppio filamento (leggere il post Retrovirus), vengono aggiunte dei pezzettini al genoma in costruzione, e queste sequenze sono rispettivamente la sequenza U3 al 5′ (prima della sequenza R) e di U5 al 3′, (dopo la sequenza R). In questo modo, quelle che nel genoma a RNA erano sequenze terminali diverse (R+U5 vs U3+R), ora sono diventate delle sequenze terminali identiche (U3-R-U5 e U3-R-U5) Queste sequenze sono chiamate LTR, Long terminal Repeats.

U3-R-U5_____________(DNA a doppio Filamento)______________U3-R-U5

All’interno del genoma, tra queste due LTR ci sono ovviamente i geni retrovirali. I tre geni più importanti sono chiamati Gag, env e pol, che codificano ciascuno per diverse proteine. Il gene gag codifica per le proteine del capside virale, Env codifica per le proteine dell’envelope e Pol codifca per proteine come la retrotrascrittasi, l’integrasi e la proteasi.
La trascrizione di questi geni inizia una volta che il Genoma a DNA si è integrato. I trascritti possono Monocistronici (ovvero contenere un solo gene) oppure policistronici. La maturazione delle proteine virali avviene poi attraverso la proteasi che dai precursori genera le proteine definitive.
Oltre a Gag, Pol e env, ci sono anche altri geni accessori che possono variare da retrovirus a retrovirus, e hanno il compito di facilitare l’operato del virus, molto famosa è, nell’HIV, la proteina Tat, codificata dal gene omonimo, che è un trans-attivatore, ovvero è una proteina che durante la trascrizione del genoma del virus integrato, si lega al trascritto nascente e permette di aumentare l’efficienza della trascrizione stessa consentendo la produzione di trascritti full-lenght, senza questa proteina il virus sarebbe in grado di sintetizzare solo messaggeri troppo corti.

Un vettore retrovirale sfrutta la capactà dei retrovirus di INFETTARE le cellule e di INTEGRARE il loro genoma in quello delle cellule ospiti. In questo modo possiamo trasferire e far esprimere geni che vogliamo ai nostri modelli sperimentali (linee cellulari, animali) in maniera permanente e stabile. Quello che ci serve prima di tutto è quindi il genoma di un retrovirus, all’interno di questo genoma che è solitamente lungo una decina di kilobasi, dobbiamo inserire il gene di interesse. I problemi sono 2, il primo è che la somma tra il genoma retrovirale e il gene di interesse non deve superare una soglia critica, perchè altrimenti il vettore non potrà essere inserito all’interno del virus (capside) stesso per motivi di spazio. Il secondo è che non possiamo lavorare con il genoma ad RNA. Per il primo problema si è fatto sì che si sviluppassero dei vettori retrovirali estremamente ridotti, ovvero contenenti soltanto le LTR terminali ed una sequenza molto importante chiamata di incapsidamento (spiegherò dopo il significato). In questo modo, avendo eliminato tutti i geni retrovirali, io posso inserire all’interno delle LTR il mio gene di interesse. Il secondo problema è stato aggirato lavorando su vettore retrovirale in DNA. Tra tutti i vettori retrovirali, i più diffusi sono quelli lentivirali (i lentivirus sono una sottoclasse dei retrovirus)

 

 

In questo Vettore retrovirale abbiamo le due sequenze LTR, e una sequenza Psi che è la sequenza di incapsidamento. Dopodichè abbiamo due geni, uno che codifica una proteina che conferisce resistenza all’ampicillina esterno alle LTR, e un altro che codifica una proteina che conferisce resistenza ad un altro antibiotico, la neomicina che è interno alle LTR e sotto un promotore specifico SV-40 (SV-40 è un promotore appartenente ad un virus delle scimmie, ma non un retrovirus). Che cosa servono questi due geni di resistenza antibiotica? Servono per selezionare. Per iniziare, devo trovare il sistema per inserire il gene di interesse nel vettore di cui vedete sopra un’immagine (esistono tantissimi tipi di vettori retrovirali, e lentivirali in particolar modo). Il modo tradizionale consiste nell’usare degli enzimi di restrizione. Un enzima di restrizione è un enzima che taglia un doppio filamento di DNA, riconoscendo una specifica sequenza. Se io taglio il mio vettore, con un enzima che riconosca una sequenza una sola volta, e che quindi faccia un solo taglio (Per fare questo c’è una mappa di restrizione che indica i diversi siti di taglio presenti sul vettore), e in particolar modo riconosca una sequenza presente nella regione chiamata MCS, io aprirò il mio vettore, lo renderò una molecola di DNA lineare. Il taglio deve generare preferibilmente delle sticky ends, in modo che, usando lo stesso enzima per il mio gene di interesse (facendo attenzione che non lo tagli in mezzo, ma solo alle estremità), Io potrò incastrare il mio gene di interesse all’interno del mio vettore linearizzato proprio perchè avranno le estremità complementari. Legando il mio gene al mio vettore, questo si ricircolarizzerà, generando una molecola di DNA circolare con dentro il mio gene. Il gene è inoltre stato inserito in mezzo alle due LTR retrovirali (perchè ho utilizzato un enzima che tagliasse nel MCS). Ci sono inoltre dei metodi per inserire il gene nella direzione giusta, in modo che sia sotto il controllo del giusto promotore retrovirale (clonaggio direzionale).
Dopodichè si utilizzano dei batteri, all’interno dei quali inseriamo il nostro vettore per aumentarne la quantità. Solo i batteri che hanno assunto il vettore saranno in grado di crescere in un terreno contenente ampicillina, in questo modo io seleziono esclusivamente i batteri che mi servono, quelli che hanno il vettore. La domanda che potreste fare è: ma se visto che ho due geni che danno la resistenza due antibiotici diversi, uno chiaramente per i batteri e l’altro per le cellule eucarioti, sono interscambiabili? Posso cioè utilizzare la neomicina per selezionare i batteri anzichè l’ampicillina? la risposta è no, perchè in questo caso il gene della resistenza alla neomicina è sotto un promotore specifico per le cellule eucarioti, e i batteri non lo leggerebbero, per cui i batteri non sono resistenti alla neomicina, mentre le cellule eucarioti non sono sensibili all’antibiotico ampicillina per cui la selezione invertita non funzionerebbe.
Una volta ottenute grandi quantità di vettore, devo passare allo step successivo. Ovvero creare il retrovirus che contenga come genoma il mio vettore che ho appena costruito. Per fare questo devo tenere conto di diverse cose. innanzitutto, il mio vettore retrovirale, che ho appena costruito da solo non è in grado di produrre nessun virus visto che gli mancano tutti i geni (che gli sono stati tolti per far spazio al gene di mio interesse). Pertanto devo utilizzare un sistema di vicariaggio, ovvero inserire artificilamente il mio vettore appena fatto in cellule apposta (trasfezione). Queste cellule sono chiamate cellule Helper, poichè portano al loro interno tutti i geni retrovirali necessari (gag, env, pol ecc) ma senza la sequenza di incapsidamento. Quindi le cellule helper sono in grado di fornire al mio vettore le proteine neccessarie a integrarsi e trascriversi, sono in grado fabbricare le proteine strutturali virali e quindi di fabbricare il corpo del virus all’interno del quale dovrà incapsidarsi il nostro vettore di interesse. A questo punto entra in gioco il secondo fattore, ovvero la sequenza di incapsidamento: mentre il vettore che contiene il gene di mio interesse contiene la sequenza di incapsidamento, quello che fornisce le proteine retrovirali no, pertanto è impossibile che si vengano a creare dei virus contenenti il vettore con gag env e pol, ma solo quello contenente il gene che voglio. Le cellule Helper sono ottenute infettando delle cellule con un retrovirus privato della sequenza psi; con i primi protocolli accadeva che durante il processo di produzione dei retrovirus, si generassero spontaneamente dei retrovirus replicazione competenti (al contrario di quelli che si volevano ottenere, dei virus replicazione-incompetenti); questa reversione spontanea era dovuta ad eventi di ricombinazione tra il vettore col gene di mio interesse e il vettore con i geni virali standard privato della sequenza psi. Per ovviare a questo problema, si iniziò a transfettare le cellule Helper con vettori separati: uno che codifica per i geni gag-pol, ed un secondo vettore che contiene invece il gene env. Il gene env è molto importante perchè codifica per le proteine di superficie, quelle dell’envelope, che sono le proteine con cui il virus riconosce le cellule e le infetta. Il gene env quindi detrmina la specificità (tropismo) del virus nei confronti dell’ospite. Oltre a questo accorgimento si iniziarono a togliere tutte le sequenze non indispensabili dai vettori helper, per ridurre la probabilità di ricombinazione.
Quindi alla fine della fiera, io inserisco il mio vettore retrovirale nelle cellule helper, e queste cellule helper dopo alcuni giorni di incubazione mi daranno numerose particelle virali contenenti il vettore di mio interesse, anche se sulla totatilità solo una percentuale sarà effettivamente attiva (alcune particelle potranno infatti essere vuote). Io quindi prelevo dal terreno di coltura di queste celluel helper i miei virus, e posso usarlo per infettare le mie cellule. Il virus che ho ottenuto, sarà quindi come stabilito, replicazione incompetente perchè il suo genoma non è in grado di produrre le proteine virali, questo fa sì che quando utilizzerò il virus appena prodotto per infettare le cellule designate, che non sono più cellule helper, ma cellule normali, si avrà soltanto il processo di infezione, di retrotrascrizione e di integrazione del genoma virale e non si avrà nessuna produzione di virus. Ovviamente le cellule da infettare devono essere compatibili con il virus ottenuto, e la compatibilità è data, come ho detto prima, dalle proteine dell’envelope.
Quindi, lo step finale è quello di utilizzare i virus prodotti per infettare le cellule, normalmente quello che si fa è di creare sia un controllo positivo che un controllo negativo. Il controllo positivo può essere un retrovirus contenete nel suo genoma il gene della GFP, in modo che questo renda facile la quantificazione dell’efficienza di infezione (in base al numero di cellule con la fluorescenza verde). Il controllo negativo è un vettore retrovirale vuoto, senza nessun gene inserito, questo serve a controllare gli effetti dell’integrazione casuale che il genoma retrovirale subisce. Inoltre, le cellule infettate col virus vengono fatte crescere in un terreno contenente neomicina (nel caso del vettore in figura), per selezionare solo le cellule che hanno integrato il vettore. Le cellule infettate quindi esprimeranno stabilmente il gene di mio interesse, e il vantaggio di usare vettori retrovirali è che l’efficienza di infezione è molto alta, molto più alta di qualsiasi altro metodo “gene-delivering”.

Ora, per finire, vorrei parlarvi delle apllicazioni pratiche di questo sistema. A cosa mi serve creare dei retrovirus per far esprimere geni di mio interesse? Beh, senz’altro a studiare gli effetti dell’espressione di uno o più geni in un sistema controllato. Ad esempio io trovo che in un particolare tipo di tumore ricorre una particolare mutazione in un gene specifico. Per dimostrare che questa mutazione sia o meno importante nella generazione del tumore, io posso utilizzare dei vettori retrovirali per infettare cellule che non esprimono quel gene con la forma mutata e con la forma standard e osservare le differenze di comportamento nelle cellule infettate.
Un altro campo di applicazione è la cosiddetta Gene-therapy, terapia genica, ovvero il tentativo di curare malattie attraverso l’espressione di geni estranei. Famoso è il caso del deficit di adenosina deaminasi (ADA-deficiency), una malattia genetica che causa una gravissima immunodeficienza congenita. Si è provato a prelevare le cellule staminali emopoietiche di bambini malati, e infettarle con un retrovirus contenente il gene dell’enzima ADA. Straordinariamente le cellule transgeniche, una volta reimmesse nel midollo osseo dei bambini, davano origine a cellule immunitarie funzionanti, eliminando così l’immunodeficienza. Questi sono rari casi di successo nei protocolli di terapia genica attualmente in corso. bisogna sottolineare come, essendo l’integrazione del virus casuale, questo possa rappresentare un rischio di mutagenesi-virus-indotta. Altre applicazioni consistono nell’utilizzare dei vettori retrovirali per far esprimere geni come l’insulina nei diabetici (in corso di sperimentazione), o di utilizzare questi vettori come “bombe” mirate a far suicidare le cellule tumorali (introducendo geni antiproliferativi come p53), il problema è quello di riuscire a costruire dei vettori specifici soltanto per le cellule tumorali.
Concludo con una nota sulla sicurezza in laboratorio durante la produzione di questi virus. Il pericolo maggiore per i ricercatori è quello ovviamente di infettarsi con il virus prodotto, questo ovviamente è tanto più possibile quanto più compatibile è il virus con l’essere umano. Per questo è obbligatorio seguire rigide preocedure di sicurezza (lavorare in laboratori attrezzati specificamente e adibiti apposta, lavorare sempre sotto cappa, indossare mascherina e indumenti protettivi ecc, buon senso)

Spero di non avervi annoiato! Se avete domande, usate i commenti!

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Unweaving Rainbows: ottica e geometria dell’arcobaleno

22 agosto 2011 in lente di barlow by Alice | 1 comment

L’arcobaleno è uno dei fenomeni ottico-atmosferici più conosciuti e scientificamente rappresenta una meraviglia perchè spiegandolo permette di entrare in contatto con molti comportamenti della luce spesso studiati in modo indipendente. Anzitutto, dall’esperienza, cosa sappiamo sull’arcobaleno? Lo vediamo quando piove, ma  solo se allo stesso tempo alcuni raggi di Sole arrivano fino a noi senza attraversare le nuvole. Vedremo che questea osservazione molto semplice ha le sue ragioni ottiche e per giungere a tali conclusioni, cominciamo a capire cosa accade alla luce all’interno di una goccia di pioggia.

In figura è possibile vedere una rappresentazione geometrica di parte del nostro problema, che trattiamo con le approssimazioni e le leggi dell’ottica geometrica. Assumendo che la luce si propaghi in linea retta possiamo vedere il raggio incidente in alto a sinistra arrivare all’interfaccia tra aria e acqua: parte di questa luce viene riflessa (ma per il momento non ce ne curiamo) e parte viene rifratta all’interno della goccia. Nella trasmissione tra un mezzo e un’altro l’angolo del raggio con la normale alla superficie cambia in base al rapporto tra gli indici di rifrazione da α a β. All’interno della goccia la luce viene trasmessa finchè non incontra un’altra interfaccia nel punto B dove viene nuovamente parzialmente rifratta e parzialmente riflessa. Questa volta ci concentriamo sulla componente riflessa, che secondo le leggi dell’ottica geometrica mantiene un angolo di β e si ritrasmette fino a C dove la componente che ci interessa (per ora) è quella trasmessa. L’angolo di deviazione del raggio uscente da quello incidente in A si può calcolare con le leggi citate sopra e con un po’ di geometria: δ=180°-2α+4β.

Un’osservazione importante è che δ non può avere qualsiasi valore (ricordiamo che la luce può colpire la goccia con molti angoli diversi) , ma (si può trovare derivando l’espressione o provando a mettere molti valori) presenta un valore minimo pari a un angolo di 137°-138°. Ciò significa che la luce che verrà complessivamente riflessa dalla goccia sarà tutta raccolta in un cono (anche perchè la goccia è simmetrica) di circa 42° di apertura. Questo risultato si può verificare osservando un arcobaleno con attenzione: l’interno dell’arco è sempre più luminoso dell’esterno.

In realtà con questo viaggio nella goccia di pioggia non si sono spiegati gli aspetti più salienti ovvero la forma e i colori. Cominciamo da questi ultimi: come probabilmente tutti sapete la luce bianca incidente, proveniente dal Sole, contiene già tutti i colori dello spettro. La goccia si comporta come un prisma, scomponendoli in un fenomeno detto dispersione. Questo comportamento della luce è legato al fatto che gli indici di rifrazione, che determinano gli angoli con cui viene rifratto il raggio, sono diversi per ogni  frequenza ovvero per ogni colore della luce. La principale conseguenza è quindi che ogni componente dello spettro avrà un cono di apertura leggermente diversa (la differenza è di pochi gradi °): all’interno di tutti i coni (nel volume che è intersezione di tutti i coni) rivedremo luce bianca, ma per angoli di apertura maggiore solo alcuni colori potranno essere “riflessi”.

Da queste figure (tratte da questo interessante sito) si dovrebbe avere un’idea intuitiva di cosa siano questi coni e come facciamo a vederli. In particolare modo dalla seconda immagine si capisce il motivo per cui la forma è quella di un arco e per cui per vedere un arcobaleno non basta una sola goccia d’acqua. Infatti, a seconda dell’angolo tra l’osservatore e la luce incidente dal Sole avremo una trasmissione fino all’occhio di luce bianca, di un determinato colore (a seconda del cono in cui si trova l’angolo) o nessuna luce (in realtà vediamo della luce diffusa, ma non quel raggio in particolare).

A questo punto, compreso il meccanismo di base, ci si possono porre problemi più complicati, ad esempio: come funzionano gli arcobaleni doppi? Se ritornate alla prima immagine, in cui si è studiato il percorso del raggio di luce all’interno della goccia d’acqua, ricorderete che in corrispondenza del punto C abbiamo trascurato la luce che veniva ulteriormente riflessa nell’acqua e ci siamo concentrati su ciò che viene rifratto. Se però ammettiamo che ci sia un’altra riflessione in C e studiamo gli angoli come fatto in precedenza si può scoprire che questa riflessione porta alla formazione di un secondo arco, i cui colori sono invertiti.

L’inversione dei colori riguarda anche le aree in cui la luce può arrivare o meno: l’area tra i due archi non riceve luce da nessuno dei due fenomeni perciò rimane più scura (si vede anche piuttosto bene dalle immagini) con la formazione delle cosiddette bande di Alessandro. Calcolando gli angoli ammessi si può inoltre osservare che è più largo rispetto a quello principale e osservando che la riflessione in C è meno probabile che la rifrazione l’arco secondario è meno intenso.

Insomma, come potete intuire a questo punto non c’è più limite alla vostra curiosità e creatività. L’ordine degli arcobaleni non si ferma infatti a 2, ma si tratta di archi sempre più flebili . Non finisce qui: si può parlare di arcobaleni gemelli, studiare la polarizzazione della luce degli arcobaleni, osservare arcobaleni lunari (chi lo dice che la luce debba venire dal Sole?) e così via…

Per chi volesse approfondire consiglio caldamento un video del MIT (in inglese) a cui mi sono pesantemente ispirata nella scrittura di questo post che approfondisce anche il discorso sulla polarizzazione. Un ottimo riferimento ricco di immagini e spunti per tutta l’ottica atmosferica merita sicuramente la vostra visita. Un altro sito di ottica atmosferica con qualche spiegazione in più.

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L’altra faccia della medaglia

11 agosto 2011 in lente di barlow by Manuel | No comments

Questo articolo deve essere letto dopo il precedente “Ci ossidiamo?”. Immagino sappiate tutti che all’inizio, agli albori della vita su questo pianeta l’ossigeno era assente o quasi, e l’atmosfera era composta da anidride carbonica, metano, ammoniaca, ecc… I primi organismi (batteri) erano quindi tutti esclusivamente anaerobi. Con l’avvento dei cianobatteri, i primi batteri fotosintetici, la vita cambiò radicalmente (ovviamente al passare di centinaia di milioni di anni). La fotosintesi vista dal punto di vista di un’equazione chimica è l’esatto contrario della demolizione degli zuccheri (ad es glucosio) ad anidride carbonica più acqua (cosa di cui ho parlato nell’articolo precedente), per cui avremo:

6CO2 + 6H2O -> C6H12O6 + 6O2

Utilizzando come materia prima dell’anidride carbonica e dell’acqua, molecole estremamente semplici, gli organismi fotosintetici sono in grado di sintetizzare zucchero, una molecola ben più complessa, il tutto sfruttando l’energia luminosa. Oltre allo zucchero viene immessa nell’ambiente una molecola di ossigeno, come fosse uno scarto (e in effetti da quest’ottica lo è). In questo modo iniziarono a svilupparsi organismi in grado di utilizzare l’ossigeno, che ora era abbondante nell’atmosfera, come accettore degli elettroni prelevati alle molecole ossidate. Questo permise di migliorare il rendimento energetico del metabolismo e diede senz’altro una spinta evolutiva. Ma l’ossigeno è una molecola che può diventare estremamente reattiva in grado di danneggiare le componenti della cellula e provocarne in certi casi la morte.
Parliamo dei radicali liberi e, nel caso dell’ossigeno, dei ROS (Reactive Oxygen Species). Per radicale intendiamo una specie chimica che presenta un elettrone spaiato nell’orbitale più esterno (Quindi presenta un numero dispari di elettroni). Questo rende la molecola o atomo estremamente instabile e del tutto propensa a reagire con altre molecole o con altri radicali. Esistono specie radicaliche con cariche elettriche mentre altre sono neutre e mentre le cariche elettriche vengono indicate con i segni + e -, la radicalità viene indicata con un pallino (•) per indicare l’elettrone spaiato. I radicali possono derivare da qualsiasi atomo o molecola, non solo dall’ossigeno. Uno degli eventi che portano alla formazione dei radicali è la Scissione Omolitica del legame: quando un legame chimico viene rotto e gli elettroni che formavano quel legame si dividono equamente tra un atomo e l’altro, abbiamo lo spaiamento degli elettroni e la formazione del radicale. Per fare un esempio, prendiamo una molecola di cloro che come l’ossigeno è biatomica; in seguito ad una scissione omolitica del legame tra i due atomi di cloro si formano due radicali, in quanto ciascun atomo di cloro ha un elettrone spaiato nel suo orbitale esterno:

Cl2 -> 2Cl•

Questi due atomi ormai radicalizzati hanno una forte instabilità, e tendono a reagire con qualsiasi molecola proprio perchè questo elettrone spaiato tende o a sottrarne ad altre molecole o ad aggiungersi ad esse (reazioni di ossidoriduzione). Ad esempio se incontrano una molecola di metano, tendono ad ossidarlo:

CH4 + Cl• -> CH3• + HCl

Il radicale Cloro ha ossidato una molecola di metano sottraendogli un atomo di idrogeno (1 protone + 1 elettrone), in questo modo il radicale cloro si è stabilizzato ad acido cloridrico (HCl), ma come conseguenza si è radicalizzato il metano stesso, a cui è stato sottratto un atomo di idrogeno e il Carbonio si è quindi trovato con un elettron spaiato (prima coinvolto nel legame con H); la reazione continua con:

CH3• + Cl2 -> CH3Cl + Cl•

Il radicale metilico ha successivamente reagito con una molecola di Cl biatomica, creando cloruro di metano e un nuovo radicale cloro. In questo modo abbiamo visto un’altra importante proprietà dei radicali, oltre quella di reagire con qualsiasi cosa passi per il convento, quella di autopropagarsi!
Che cosa può portare alla scissione omolitica? Ad esempio le Radiazioni Ionizzanti (ad esempio, nella prima reazione di radicalizzazione del cloro possono intervenire le RI), oppure energia termica oppure una reazione chimica di ossido-riduzione (come nell’ultima reazione tra il radicale metilico e il cloro).
Ma veniamo all’ossigeno. L’ossigeno essendo molto utilizzato dal nostro organismo è quello che più probabilmente darà origine a specie radicaliche ed è per questo che è molto pericoloso. Ha otto elettroni, e questa configurazione elettronica: 1s2 2s2 2p4, ma la particolarità è che ha ben due elettroni spaiati: un orbitale 2p ne alloca due, gli altri due uno ciascuno. I due elettroni spaiati rendono l’ossigeno particolarmente reattivo di suo e questo lo rende adatto come accettore finale degli elettroni (e anche, tra parentesi, alla formazione della molecola d’acqua):

O2 + 4e- + 4H+ -> 2H2O

Gli elettroni, come ho detto nell’articolo precedente, provengono dalle molecole che venono ossidate durante il metabolismo. La riduzione dell’ossigeno ad acqua avviene nei mitocondri con l’acquisto di un elettrone alla volta. Può capitare che non avvenga la riduzione completa e che specie semi-ridotte fuggano nell’ambiente circostante sottoforma di radicali, questa è nè più nè meno che una normale conseguenza del nostro metabolismo ossidativo. Vediamo cosa accade, quindi:

O2 + 1e- + 1H+ -> HO2•

Se l’ossigeno riceve solo un elettrone si riduce parzialmente e diventa un radicale, perchè possiede un elettrone spaiato. Questo radicale (HO2•) viene detto radicale Idroperossile, ed è estremamente reattivo; normalmente questo radicale ha un’emivita molto breve e dissocia velocemente, formando un altro radicale, l’anione superossido: O2-•. Tutti questi radicali si diffondono molto velocemente nella cellula, reagendo con tutto quello che incontrano e propagandosi. Se contemporaneamente all’anione superossido, si viene a formare Perossido di Idrogeno a partire dal radicale idroperossile (HO2• + 1e- + 1H+ -> H2O2), si ha la cosiddetta reazione di Haber-Weiss e la formazione di un altro dannoso radicale dell’ossigeno, il radicale Idrossile:

H2O2 + O2-• -> OH- + OH• + O2

Abbiamo visto quindi che a causa di reazioni di ossido-riduzione si possono ottenere diverse specie reattive dell’ossigeno, alcune con carica altre neutre, tutte estremamente instabili e reattive. Quelle più pericolose sono quelle senza carica perchè essendo apolari possono attraversare le membrane fosfolipidiche e diffondersi. Ma quali sono i danni che possono arrecare ad una cellula? I più comuni problemi sono dati dall’attacco del DNA. Questi radicali dell’ossigeno sono in grado di reagire con le basi azotate e ossidarle, inducendo mutazioni. Possono anche indurre la rottura dei filamenti del DNA causando danni maggiori. I radicali liberi possono anche attaccare le proteine e alterarne la struttura, ad esempio tutte le proteine che hanno dei residui di cisteina (che hanno quindi dei gruppi sulfidrilici -SH) possono subire l’ossidazione e formare un legame tra due gruppi SH (S-S) e viceversa. Ma forse il danno più grave è quello alle membrane. Le membrane cellulari sono costituite da un doppio strato fosfolipidico; Un fosfolipide è una molecola costituita da una parte polare (carica elettricamente, di solito un gruppo fosfato più un fruppo funzionale come la colina, l’etanolammina ecc..) e da due lunghe catene di acidi grassi; Un acido grasso è una catena idrocarburiche totalmente apolari (tranne che per il carbonio 1 che, portando il gruppo chimico acido, COOH, è polare). Una catena idrocarburica è costituita dalla ripetizione N volte del gruppo -CH2-. In una membrana i due strati fosfolipidici sono giustapposti proiettando verso l’interno le catene apolari e verso l’esterno le teste polari (fosfato & Co.), solo in questo modo le membrane possono interagire con un ambiente in prevalenza acquoso (ricordo che una molecola apolare non si scioglie in acqua, come ad esempio l’olio nel brodo che forma delle chiazze galleggianti). Le nostre membrane cellulari sono fondamentali perchè conferiscono integrità alle cellule e le mantengono separate. Inoltre sono responsabili degli scambi di molecole con l’ambiente esterno. Molte catene degli acidi grassi possiedono delle insaturazioni, ovvero dei doppi legami; un doppio legame si forma in seguito ad una ossidazione della catena:

-CH2-CH2-CH2-CH2-CH2- -> -CH=CH-CH2-CH=CH-

Questa catena idrocarburica ha subito due insaturazioni: al C1 e al C4, diventando così poli-insatura. Molte catene idrocarburiche nelle nostre membrane sono poli-insature (gli acidi grassi poli-insaturi che i nutrizionisti chiamano omega-3, omega-6 e omega-9). Se le nostre membrane vengono attaccate da specie radicaliche come il radicale idrossile (OH•), questi radicali vengono “spenti” proprio dai nostri acidi grassi poli-insaturi che subiscono però delle perossidazioni (Aggiunta di OOH ad un carbonio).

LH + OH• + O2 -> LOO• + H2O

Dove L è un lipide generico che viene radicalizzato da un OH•, che si riduce ad acqua, in LOO•; Questa forma è instabile perchè è essa stessa un radicale per cui è in grado di attaccare altri lipidi di membrana e di propagarsi allo stesso modo, ma è anche in grado di spegnersi (LOO• + LOO• -> LOO-OOL). Quindi le membrane possono tamponare uno stress ossidativo, e per questo sono utili, ma se quest’ultimo dovesse essere troppo grande gli acidi grassi perossidati LOOH diventerebbero molti; una molecola che si lega all’ossigeno diventa polare, la polarizzazione degli acidi grassi delle membrane (che dovrebbero essere apolari) attira molecole di acqua (polare anch’essa), e l’entrata dell’acqua all’interno del doppio strato fosfolipidico porta al suo scompaginamento, la membrana si dissolve (si solubilizza) e questo porta alla perdita dell’integrità cellulare, quindi alla morte della stessa (fenomeno noto come perossidazione lipidica e solvatazione delle membrane).
In condizioni normali, la generazione di radicali è perfettamente contenuta, ma in particolari situazioni patologiche o ambientali (esposizione a agenti tossici come il tetracloruro di carbonio, fumo di sigaretta e farmaci come il paracetamolo, o radiazioni ionizzanti) si può generare uno stress ossidativo molto forte che può causare la morte di molte cellule (necrosi tissutale).
Il nostro organismo ha svliuppato molte difese nei confronti dei radicali, quindi normalmente li teniamo sotto controllo e non permettiamo che causino danni. Esistono difese enzimatiche (enzimi in grado di spegnere la propagazione dei radicali) e difese non enzimatiche, molecole che vengono ossidate/ridotte dai radicali che in questo modo si spengono, prima fra tutte la vitamina C. Spero di non essere stato troppo prolisso e spero vi abbia interessato. Ho voluto sottolineare come la formazione di ROS sia quasi “fisiologica” in un metabolismo ossidativo come il nostro e che normalmente riusciamo ad annullarne gli effetti tossici, ma ho sottolineato che come a volte capiti che le nostre difese non bastino e in questo caso i danni possono essere gravi. Alla prossima

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Ci ossidiamo?

1 agosto 2011 in lente di barlow by Manuel | 3 comments

Se non l’avessi ripetuto praticamente in ogni articolo che ho scritto, magari vi farebbe più effetto, ma non sto esagerando quando vi dico che ciò di cui voglio parlarvi è della massima importanza. Tutti i sistemi viventi hanno bisogno di energia. Questa energia è necessaria per mantenere il sistema vivente lontano dall’equilibrio con l’ambiente circostante. Quando un organismo muore, smette di ricavare (non dal nulla ma per conversione) energia utile, e questo col tempo lo porta a “disorganizzarsi” e a tornare in equilibrio con l’ambiente circostante, in un certo senso torna alla natura. Dove è possibile individuare questa organizzazione superiore negli organismi viventi? Ma ovunque! La più piccola e semplice cellula del più antico batterio ha un livello di organizzazione straordinario! innanzitutto è separato dall’ambiente esterno da una membrana fosfolipidica a sua volta ricoperta da una parete cellulare rigida, questa parete serve a proteggerlo, a mantenere insieme tutte le componenti interne (DNA, RNA, proteine ecc..) e a mediare gli scambi con l’esterno! Mantenersi “divisi” dall’ambiente esterno è fondamentale. Poi prendiamo le proteine. Le proteine sono costituite dall’unione di amminoacidi, che ne sono venti in tutto. Per sintetizzare una proteina innanzitutto è necessario avere l’informazione per farlo (proveniente dal DNA), quindi è necessario avere l’occorrente: amminoacidi, energia, e un sistema di sintesi. da un insieme disordinato di amminoacidi singoli, otteniamo un prodotto finale estremamente più complesso, e questa sua complessità va molto al di là della semplice somma della funzione dei singoli amminoacidi, e dipende soprattutto dalla struttura e dalla conformazione della proteina: interferire con la struttura significa annullare la funzione della proteina e ridurla ad una semplice successione di amminoacidi.
Come ottenere l’energia adatta? Innanzitutto, come dice la prima legge della termodinamica, l’energia non può essere creata nè distrutta ma soltanto convertita. Ed è proprio quello che fanno i sistemi viventi. Per ottenere l’energia i sistemi viventi necessitano di molecole di cui possono “utilizzare” i legami chimici.
Il modo più comune per ricavare energia da una molecola è ossidarla. Cosa significa ossidare lo vedremo subito.
Dal punto di vista biologico (e non solo) molto importanti sono le reazioni di ossido-riduzione. Una specie chimica che si ossida è una specie chimica che “perde” elettroni mentre quella che li riceve si riduce. Ovviamente se una specie si ossida ce ne deve essere un’altra che alla fine si riduce, in questo modo il numero di elettroni (o equivalenti riducenti) rimane invariato nella reazione. Ma facciamo alcuni esempi di come le specie chimiche possono ossidarsi e ridursi:
la formazione della ruggine è il più classico esempio di reazione di ossido-riduzione, la cui reazione è la seguente:

3Fe + 4H2O -> Fe3O4 + 4H2

Il ferro, il cui numero di ossidazione a sinsitra della reazione è 0 (essendo sottoforma di ferro elementare privo di carica non ha elettroni nè in eccesso nè in difetto) a destra della reazione è +4 (sono stati persi quattro elettroni) mentre l’ossigeno li ha acquistati, ma visto che l’ossido di ferro (III) è una specie chimica nuova, l’ossigeno non ha propriamente sottratto gli elettroni al ferro, perchè comunque contribuiscono a formare il legame. Abbiamo quindi visto quindi che per ossidarsi una specie chimica può legarsi all’ossigeno (d’altronde ossidare deriva da ossigeno).
Una specie chimica però può perdere definitivamente gli elettroni a favore di un’altra:

Fe2+ + Cu2+ -> Fe3+ + Cu+

Infine, possiamo ossidare una specie chimica sottraendo atomi di idrogeno. Gli atomi di idrogeno sono costituiti da un protone ed un elettrone. Sottraendo entrambi, non si determina la formazione di una carica netta (specie ionica), ma la specie chimica ha perso a tutti gli effetti un elettrone. Solitamente gli atomi di idrogeno vengono tolti sempre in coppia, come nell’esempio:

CH3-CH2-CH2-CH3 -> CH3-CH=CH-CH3

Il butano ha quindi dubito una deidrogenazione del carbonio 2 e del carbonio 3 che trobandosi ciascuno un elettrone libero l’hanno successivamente impegnato in un doppio legame (formando così il 2-butene). E’ stata introdotta un’insaturazione.
Come dicevo nei sistemi biologici le reazioni di ossidoriduzione sono centrali nel metabolismo. Per ottenere energia vengono ossidate le molecole (come zuccheri, acidi grassi), ad esempio una molecola di glucosio, uno zucchero a sei atomi di carbonio estremamente importante perchè è una delle poche fonti di energia di molti tessuti come il cervello (che non è in grado di metabolizzare grassi), viene incanalato in una via metabolica chiamata glicolisi. La glicolisi (la via centrale del metabolismo degli zuccheri) prende una molecola di glucosio e ne ottiene due di acido piruvico (piruvato) secondo la seguente reazione:

C6H12O6 -> 2X C3H4O3

Noterete subito che l’unica cosa ad essere cambiata è il numero degli idrogeni che passano da 12 a 8. Ben quattro atomi di idrogeno sono stati prelevati dal glucosio (che si è ossidato a piruvato) e sono stati trasferiti. L’accettore di questi atomi di idrogeno (quindi 4 elettroni) è una molecola organica estremamente importante, il NAD (Nicotinammide-Adenin-Dinucleotide). Il NAD è una molecola non proteica che si associa transientemente agli enzimi che operano le reazioni di ossidoriduzione (si dice che è un cofattore) che si chiamano ossidoreduttasi o più comunemente deidrogenasi. Le deidrogenasi sono in grado di sottrarre elettroni ad una specie chimica trasferendoli su questa molecola che da ossidata (NAD+) si riduce (NADH), ma sono anche in grado di ridurre con il procedimento opposto. Quindi è il NAD a ridursi, a prendere gli elettroni sottratti al glucosio. Una molecola di NAD è in grado di ridursi a NADH accettando su di sè 2 elettroni ed un protone (ione idruro) liberando nell’ambiente circostante il protone rimanente. Per cui la reazione prima scritta diventa:

C6H12O6 + 2NAD+ -> 2X C3H4O3 + 2NADH + 2H+

L’enzima della glicolisi responsabile dell’ossidazione del glucosio è la Gliceraldeide-3fosfato Deidrogenasi , per gli amici GAPDH. Le deidrogenasi che funzionano con il NAD+/NADH sono dette deidrogenasi piridiniche, ma il NAD non è l’unico cofattore a potersi ridurre/ossidare, esistono anche cofattori cosiddetti flavinici (con le conseguenti deidrogenasi flaviniche) che sono FMN e FAD . Due considerazioni. La prima: la glicolisi è una via che da sola è in grado di produrre energia, sottoforma di ATP (le cellule immagazinano l’energia in legami chimici ad alta energia, come il legame tra i gruppi fosfato dell’ATP). Da una singola molecola di glucosio la glicolisi ricava 2 molecole di ATP (in realtà 4, ma se ne spendono due all’inizio pertanto il bilancio è 2). Questo ATP, questa energia ottenuta dal glucosio, non è però ottenuta grazie agli elettroni sottratti, ma attraverso un processo nominato “fosforilazione dell’ADP ad ATP a livello del substrato”, che in parole povere significa che il legame altamente energetico dell’ATP (ADP + P -> ATP) viene sintetizzato rompendone un altro a maggior contenuto energetico. Questi legami a maggior contenuto energetico di quello dell’ATP sono rispettivamente quello dell’acido 1-3 bifosfoglicerico e dell’acido fosfoenolpiruvico, entrambi intermedi della glicolisi e dai quali, appunto viene sintetizzato ATP (l’ATP non è quindi la molecola a più alto contenuto energetico, ma si trova esattamente a metà). La seconda considerazione è che se i NADH ottenuti non si riossidassero alla fine della glicolisi, si arriverebbe ad un punto che non si avrebbe nessun NAD ossidato, e questo come potete capire interromperebbe la glicolisi stessa. Per cui il NADH deve essere periodicamente riossidato per potere tornare utile alla glicolisi. Come si riossida? Se non è presente ossigeno, e siamo quindi in condizioni di anareobiosi, come ad esempio nel muscolo sottosforzo (ad esempio in un atleta durante una maratona), il NADH viene riossidato sul piruvato stesso, che viene ridotto ad acido lattico dall’enzima lattico deidrogenasi. L’acido lattico è un componente tossico perchè abbassa il pH per cui il muscolo non può lavorare a lungo senza ossigeno:

2X C3H4O3 + 2NADH + 2H+ -> 2X C3H6O3 + 2NAD+

In virtù del fatto che non si spreca mai niente, dopo lo sforzo eseguito, l’acido lattico viene portato al fegato dove viene trasformato in glucosio attraverso un processo di gluconeogenesi, e come potrete capire in questo caso serviranno equivalenti riducenti!
Se invece è presente ossigeno, come nella maggioranza dei tessuti in condizioni normali, allora il discorso si complica, perchè a questo punto non ci si ferma più solo alla glicolisi, ma si entra in un famoso processo chiamato “Respirazione Cellulare”. Nella respirazione cellulare ci sono tre fasi. La prima fase, indipendentemente da che molecola si parte (zuccheri, grassi, proteine) porta alla formazione di una molecola molto importante: l’acetil coenzima A: una molecola a due atomi di carbonio (acetile) coniugata ad un cofattore molto importante il coenzima A, Il coenzima A come potete vedere ha un gruppo SH (zolfo-idrogeno, chiamato gruppo tiolico), ed è proprio a questo gruppo SH che si coniuga l’acetile. Ora, noi nella glicolisi siamo arrivati al piruvato. Il piruvato rappresenta un bivio, se non c’è ossigeno viene ridotto ad acido lattico, se c’è ossigeno allora entra nel mitocondrio e viene ossidato ad acetile (perde quindi un atomo di carbonio sottoforma di CO2) e viene coniugato al coenzima A (Il tutto grazie ad un complesso multienzimatico chiamato Piruvato Deidrogenasi). L’acetil Coenzima A a questo punto entra nella seconda fase, sempre nel mitocondrio, il cosiddetto ciclo di Krebs, noto come Ciclo dell’Acido citrico o Ciclo degli acidi tricarbossilici. In questa via metabolica ossidativa, l’acetile viene ulteriormente ossidato a 2 molecole di CO2, con la produzione di 3NADH e 1 FADH2.
Partendo quindi da una molecola di glucosio (C6H12O6) otteniamo 2 molecole di piruvato (C3H4O3).Dal piruvato otteniamo 2 molecole di Acetil Coenzima A (un acetile è C2H4O2) perdendo in questo passaggio 2 molecole di C02. I due acetil Coenzima A vengono ulteriormente ossidati a 4CO2. Vengono ridotti 8NADH (2 nella glicolisi e 3 per ciascuno dei due acetil coenzima A) e 2FADH2.

La grande resa energetica di queste vie metaboliche è ottenuta proprio grazie agli elettroni sottratti al glucosio (in questo caso) e conservati nei cofattori ridotti NADH e FADH2. Questi elettroni sono i responsabili della sintesi di grandi quantità di ATP. Il problema è dove metterli? Che cosa si può ridurre con questi elettroni? Ma l’ossigeno naturalmente. L’ossigeno è l’accettore finale di tutti gli elettroni sottratti alle molecole ossidate per produrre energia. L’ossigeno si trova sottoforma di molecola biatomica O2. I cofattori ridotti vengono a loro volta ossidati da delle proteine presenti nei mitocondri (dove avviene sia il ciclo di Krebs che la riduzione dell’ossigeno, che la sintesi di ATP). Queste proteine formano una specie di catena, attraverso cui gli elettroni passano ordinatamente, per arrivare all’ossigeno. Durante il passaggio degli elettroni da una proteina all’altra, viene liberata dell’energia (eV) che viene utilizzata per creare un gradiente chimico di protoni (H+) tra un lato e l’altro della membrana mitocondriale (le proteine attraverso cui passano gli elettroni dei cofattori, sono inserite nella membrana interna del mitocondrio, e quando passano gli elettroni usano l’energia liberata da loro per creare una differenza di potenziale tra un capo e l’altro della membrana). Gli elettroni arrivano all’ossigeno riducendolo ad Acqua, e la differenza di potenziale a livello della membrana mitocondriale viene utilizzata per sintetizzare ATP a partire da ADP + P, grazie ad un enzima chiamato ATP sintasi.

O2 + 4e- + 4H+ -> 2H2O.

Vengono sintetizzati 3ATP per ogni NADH che si riossida, e 2 ATP per ogni FADH2 che si riossida. L’efficienza è del 42% circa.
L’equazione finale diventa quindi:

C6H12O6 + 6O2 -> 6CO2 + 6H2O

Abbiamo quindi visto come il flusso degli elettroni dal glucosio (o qualsiasi molecola) all’ossigeno è importantissima per produrre energia! Abbiamo anche capito perchè il ciclo di Krebs e la catena di trasporto degli elettroni si chiama respirazione cellulare, perchè consuma ossigeno e produce anidride carbonica, come durante la respirazione polmonare!
Alla prossima e mi raccomando usate i commenti! Spero vi sia piaciuto questo articolo!

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