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Proteine Autonome

7 maggio 2011 in dendrite by Manuel | No comments

Siamo estremamente propensi a classificare ogni cosa ci si pari davanti. La classificazione è sempre stato uno strumento estremamente utile, che permette di mettere ordine in un mondo estremamente eterogeneo.
Le classificazioni, tuttavia, hanno sempre qualcosa di arbitrario, perchè siamo noi che decidiamo di classificare in base ad una particolare caratteristica. Per cui è normale scoprire cose che sfuggono ad ogni classificazione preesistente. E questi sono i casi più interessanti ed intriganti. Tutto questo sproloquio per arrivare a parlarvi di un argomento che sfugge alle classificazioni prefissate e che diversi anni fa è anche arrivato sulla bocca di tutti, per cui chiunque ne parlava.
Di solito le cose di cui parlo non sono mai allegre, e questa non fa eccezione. Vi ho avvertiti.
Normalmente noi e anche i medici distinguiamo molto nettamente le malattie infettive da tutte le altre. Le malattie infettive sono delle malattie la cui causa è un microorganismo (virus, batterio, protozoo) e che di solito si diffonde tra individuo e individuo (direttamente o indirettamente attraverso vettori come ad esempio gli insetti). Queste malattie sono per molti aspetti monofoattoriali, anche se non è sempre vero, perchè in molti casi non è sufficiente il Microorganismo perchè si sviluppi la malattia. Le malattie genetiche invece sono su un pianeta completamente diverso.Sono le malattie trasmesse dai genitori ai figli e sono causate da mutazioni genetiche. Ci sonio malattie genetiche cosiddette Mendeliane o monogeniche, perchè la loro trasmissione è predetta in modo abbastanza accurato dalle leggi di Mendel e ci sono le malattie complesse che invece hanno dei modelli di trasmissibilità più complessi e non sempre del tutto prevedibili. Come vedete sono due universi molto distanti. Vi potrebbe mai venire in mente l’esistenza di qualcosa che possa risultare da un’intersezione di questi due insiemi? Ebbene, in qualche modo esiste.
Sin dall’inizio dello scorso secolo, si iniziò a sostenere che alcune patologie neurodegenerative potessero essere causate da un agente infettivo, soprattutto in base all’analisi di campioni istologici provenienti da una popolazione indigena della Nuova Guinea in cui questa patologia si trasmetteva da individuo a individuo. La popolazione colpita chiamava quella malattia Kuru, che nella loro lingua significa Brivido. Il Kuru portava inevitabilmente alla morte del malato, con progressiva paralisi, brividi, e alterazioni del linguaggio e deficit cognitivi. Era (ormai è praticamente debellata) una malattia con un tempo di latenza di molti anni, ma una volta che si presentavano i primi sintomi, portava alla morte in pochi mesi. Le analisi che vennero eseguite sui cervelli di questi individui mostrarono una diffusa degenerazione delle cellule del sistema nervoso centrale, degenerazione che venne definita “spongiforme”, perchè evidentemente l’aspetto istologico assomigliava ad una spugna. Si pensava che fosse dovuta ad un’infezione di qualche microorganismo, dovuta ad un particolare rituale di cannibalismo che veniva da loro eseguito durante i funerali, cibarsi cioè dei cervelli dei defunti (sembra una storia di Zombie) e per molto tempo si cercò di individuarlo.
Parallelamente, negli anni 20 del ’900, due medici tedeschi individuarono una degenerazione nervosa che si sarebbe poi rivelata molto simile al Kuru, e venne chiamata Morbo di Creutzfeldt-Jacob. Questa patologia però non sembrava essere infettiva, anzi, in alcuni casi sembrava piuttosto essere genetica, con un’incidenza più alta in alcune popolazioni come gli ebrei Aschenaziti (con il grado di Endogamia che presentavano, c’è poco da stupirsi che molte malattie genetiche colpissero quasi esclusivamente loro, ad esempio la malattia di Tay Sachs, ed è così tutt’oggi).
Aggiungiamo, per complicare il quadro, che anche altri animali oltre all’uomo, sembravano soffrire di questa patologia, in particolare le pecore, nelle quali veniva chiamata Scrapie.
Un bell’enigma, che rimase insoluto per molti decenni ancora. Inizialmente si credeva fosse dovuto ad un virus, un virus anomalo, fino a quando un certo Prusiner iniziò a scoprire, studiando il cervello di alcuni roditori (criceti) che presentavano questa degenerazione, che nessun acido nucleico di origine virale poteva essere isolato, ma anzi, che il materiale isolato dai cervelli era di natura esclusivamente proteica. Quando riuscì a purificare abbastanza la proteina potè sequenziarla, e dalla sequenza di amminoacidi potè ottenere informazioni sul gene che doveva codificarla, e, rullo di Tamburi, non era un gene virale, ma un gene endogeno, presente in tutti i mammiferi. Ovviamente, quando si inoculava questa proteina in animali sani, questa proteina poteva causare la malattia. Quindi, in pratica, era una proteina la responsabile della diffusione di queste malattie, non un microorganismo. Un agente non vivente, da solo, è in grado di indurre degenerazione del sistema nervoso. Una proteina, tra l’altro, endogena.
Si iniziò quindi a studiare il gene. Si scoprì che animali geneticamente modificati che non avevano questo gene erano perfettamente normali, quindi non si riuscì (e non si riesce bene neppure ora) a scoprire a cosa serva questa proteina; ma la notizia più interessante venne quando si inoculò l’estratto di proteine purificato dal cervello di un animale malato in un animale senza il gene, e si scoprì non si verificava nulla di nulla. L’animale geneticamente modificato non si ammalava.
Intanto, la proteina venne chiamata Prione (Prion, in inglese), abbreviata PrP, codificata dal gene PRNP. E’ una proteina di 209 amminoacidi, e normalmente è una proteina di membrana. Il problema era che non si capiva come potesse essere la responsabile della neurodegenerazione.
Sia chiaro, il problema non è di per sè come una proteina possa causare neurodegenrazione; molte malattie neurodegenerative, come Alzheimer e Parkinson, sono causate da proteine alterate che si depositano in aggregati insolubili dentro e/o fuori i neuroni e li fanno degenerare. Il problema semmai è come fa una proteina, o un estratto di proteine, a propagare la patologia da un individuo all’altro. Se io prendo da un cervello di un individuo malato di alzheimer la proteina responsabile (la Beta-Amiloide) e la inoculo in un altro individuo, questo non svilupperà l’alzheimer (anche se ci sono prove sperimentali che in alcuni casi, aggregati proteici di amiloide possono essere causati attraverso la propagazione di proteine alterate). Se lo faccio con i prioni invece accade!
La risposta a questo dilemma venne quando si studiò la struttura della proteina con la Risonanza Magnetica Nucleare(NMR). Si scoprì che la proteina prionica poteva esistere in due conformazioni completamente diverse, pur avendo la stessa sequenza amminoacidica (il che era assolutamente impensabile). Una prevedeva la presenza di Alfa-eliche, l’altra, invece, di Beta-foglietto. L’immagine dovrebbe aiutarvi a capire:

Se ad una “popolazione” di prioni in struttura ad alfa-elica (PrP-C) viene aggiunto un piccolo quantitativo di proteina a Beta-foglietto (PrP-sc), entro poco tempo, tutte le proteine assumono la conformazione a beta foglietto. Sembra che la proteina a beta foglietto funzioni come stampo su cui quella ad alfa elica si adatti, probabilmente passando attraverso stati intermedi e forse con l’aiuto di qualche fattore ancora ignoto.
Apparve fin da subito che la forma a beta foglietto era la forma responsabile della patologia, mentre quella ad alfa elica era la conformazione che naturalmente la proteina assume.
Divenne altresì chiaro che nei casi evidenziati del morbo di Creutzefeldt-Jacob che erano a chiara trasmissione ereditaria, la patologia era dovuta a delle mutazioni che facevano sì che la proteina prionica assumesse la conformazione a Beta-foglietto (PrP-sc). Questa conformazione alterata rende la proteina particolarmente suscettibile all’aggregazione, e si è dimostrato che l’aggregazione di prioni alterati porta alla formazione di corpuscoli insolubili e difficilmente eliminabili di queste proteine. E’ questo il meccanismo patogenetico della degenerazione nervosa. La degenerazione spongiforme da Prione è però nella maggiorparte dei casi sporadica. Sono note mutazioni genetiche ereditarie, ma in molti casi non è ravvisabile alcuna familiarità. Si ritiene che in questi casi la proteina normale assuma “spontaneamente” la conformazione alterata, causando la malattia. Questo è possibile perchè se vi ricordate la proteina alterata può indurre quella normale ad assumere la conformazione a beta foglietto! in questo modo basta che poche proteine assumano la conformazione sbagliata per far sì che il meccanismo patogenetico si avvii (Si può anche capire, quindi, il motivo di un periodo di latenza così lungo). E’ quindi questo il modo attraverso il quale le malattie da prioni si possono propagare nella popolazione. Quindi il il morbo di Kreutzfeldt-Jacob e il Kuru sono due facce della stessa medaglia. Il primo è ereditario o comunque spontaneo, mentre il secondo si trasmette da un individuo all’altro attraverso l’assunzione di tessuti con proteine alterate, proprio in virtù delle proprietà dei prioni.
Sono stati anche dimostrati casi in cui soggetti che hanno ricevuto un trapianto di cornee da soggetti con queste mutazioni, hanno sviluppato la patologia a causa della contaminazione del tessuto con proteine prioniche alterate.
Quindi, un caso assolutamente incredibile in cui basta una piccola contaminazione da proteine alterate per indurre le proteine normali ad assumere la conformazione alterata!! Non so se anche voi, come me, vi stupite nell’immaginare una cosa simile. Ed ecco spiegato come mai animali senza il gene per i prioni non sviluppavano la malattia in seguito al contatto con proteine alterate: perchè non avevano una proteina normale che si potesse alterare.
Fino ad ora ho parlato di trasmissione uomo-uomo, ma ci sono stati anche dei casi di trasmissione animale-uomo, di cui tutti abbiamo sentito parlare: vi dice niente il morbo della mucca pazza? Ebbene, la BSE, encefalopatia spongiforme bovina, è una malattia da prioni alterati che si trasmetteva tra i bovini che venivano nutriti con mangimi in cui venivano aggiunti resti di altre mucche, in questo modo i Prioni alterati si sono diffusi e hanno causato alcune centinaia di migliaia di casi di mucca pazza. Ma la trasmissione ha fatto un salto di specie, in seguito alla contaminazione della carne di mucca con queste proteine, che resistenti alla cottura e al nostro sistema digerente, hanno causato degenerazione nervosa in alcune persone: 214 casi in tutto segnalati, di cui 167 in UK e 25 in Francia. I prioni bovini alterati, proprio come virus, “infettavano le carni, e riuscivano a propagare l’alterazione nei prioni umani!
Tutto questo, comunque, vuole anche sottolineare come anche le proteine siano in grado di trasmettere informazioni, oltre agli acidi nucleici. E questo non è solo il caso dei prioni, ma anche degli istoni con l’epigenetica!
Spero di essere riuscito a farvi capire quanto questo processo, per quanto tragico, sia comunque affascinante da un punto di vista strettamente biologico. Come una malattia genetica possa diffondersi da persona a persona, come una proteina possa corromperne un’altra! Alla fine, comunque, non finiremo mai di stupirci.
Come sempre, interagite!! i commenti esistono per questo! Alla prossima!

Bibliografia:
Molte informazioni e l’immagine sono prese da:
Erling Norrby, “Prions and protein folding diseases” J. internal medicine, Apr. 2011

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A ciascuno il suo!

14 aprile 2011 in dendrite by Manuel | 9 comments

Dopo tanto parlare di cose tristi torniamo a parlare di qualcosa di più leggero. Un sistema di regolazione cellulare estremamente raffinato e conservato evolutivamente, al quale però si pensa poco normalmente. Quando all’interno del nucleo di una cellula è attivata la trascrizione genica, verranno prodotti i rispettivi RNA messaggeri che, sempre all’interno del nucleo, verranno processati (Capping all’estremità 5′, poliadenilazione all’estremità 3′ e splicing). Una volta che questi RNA messaggeri sono maturati, devono venire tradotti in proteine. Il macchinario che si occupa di questa traduzione è il Ribosoma. Il ribosoma è una macchina complessa costituita da diversi RNA (chiamati RNA ribosomali, trascritti a partire da specifici geni dalla RNA polimerasi I, mentre gli RNA messaggeri sono trascritti dalla RNA polimerasi II), Questi RNAs si assemblano con delle proteine a formare due subunità, una maggiore ed una minore. La distinzione fra le due viene fatta in base al loro rispettivo Coefficiente di sedimentazione di 60 e 40 svedberg (S), (potremmo pensare che le due subunità messe assieme formino un ribosoma di 100 S, ma non è così, i due coefficienti non sono addittivi e il ribosoma finale ha un coefficiente di 80 S). i ribosomi sono localizzati esclusivamente nel citoplasma, e possono essere liberi, oppure associati al reticolo endoplasmatico. Questo vuol dire che gli RNA messaggeri devono uscire dal nucleo ed andare nel citoplasma per essere tradotti. Questo passaggio avviene attraverso dei pori presenti sull’involucro nucleare (la membrana che delimita il nucleo) e facilitato da proteine appartenenti alla famiglia delle Esportine (se pensate che i biologi abbiano poca fantasia avete ragione, e sappiate che esistono anche le importine).
Una volta che l’RNA messaggero è stato esportato nel citoplasma si lega alla subinità minore del ribosoma, attraverso il riconoscimento di una sequenza all’inizio del messaggero, circa 5-10 basi prima del codone di inizio (un codone è una tripletta di nucleotidi, ad esempio ACC, e ciascun codone corrisponde ad un amminoacido. Ad esempio AAC codifica per la Treonina. In realtà per ciascun amminoacido ci sono più codoni) ed è grazie al riconoscimento di questa sequenza che è possibile tradurre correttamente il mRNA. Questa sequenza è chiamata di Shine-Dalgarno per i procarioti e di Kozak per gli eucarioti. Il ribosoma legge il messaggero di codone in codone associando al codone l’amminoacido corrispondente. La fine della traduzione è data da particolari codoni, detti codoni di stop, che corrispondono a UAA, UAG e UGA (mentre di solito il codone di inizio è sempre AUG).
Per curiosità, numerosi antibiotici, che come saprete sono farmaci che si prendono per infezioni batteriche, hanno come obiettivo quello di inibire l’attività del ribosoma e quindi impedire la sintesi proteica. Ovviamente gli antibiotici che prendiamo sono selettivi per i ribosomi batterici e quindi non interferiscono con i nostri.
Ma arriviamo al dunque, l’argomento che mi interessava sviluppare, ovvero la straordinaria capacità della cellula di compartimentare i messaggeri al suo interno, di distribuirli e di tradurli asimmetricamente nel volume cellulare. Per farmi capire, esistono due modelli: il primo che prevede che la localizzazione dei singoli messaggeri sia casuale all’interno della cellula, e l’altro che siano distribuiti in maniera specifica e precisa, e quindi asimmetrica. Questo si traduce in termini di probabilità: nel primo modello la probabilità di trovare un singolo specifico messaggero è uniforme in tutta la cellula, nel secondo invece avremo un massimo di probabilità di trovarlo in una determinata regione, e un minimo di trovarlo altrove. Ovviamente il più conforme ai dati sperimentali è proprio il secondo. I classici esempi che vengono fatti sono due: la cellula epiteliale e il neurone. La cellula epiteliale, come dice il nome, costituisce gli epiteli. Prendiamo ad esempio le cellule dell’epitelio intestinale.

Queste cellule sono estremamente specializzate nell’assorbire nutrienti e immetterli nel circolo sanguigno. Formano quindi una barriera selettiva. Queste cellule sono, come si usa dire in gergo, polarizzate perchè hanno due distinti poli: il polo apicale, quello cioè superiore che è rivolto verso la cavità intestinale (lume) e il polo basale che è invece rivolto verso il tessuto connettivo sottostante. Queste due regioni sono estremamente specializzate perchè è necessario che i nutrienti seguano un flusso il più possibile unidirezionale, dal lume al sangue attraverso la cellula; per questo la superficie apicale sarà ricorperta di trasportatori specifici in grado di trasportare i nutrienti dal lume al citoplasma, e la superficie basale sarà invece piena di trasportatori che dal citoplasma trasportano i nutrienti al sangue. Se andassimo a identificare le proteine presenti in queste due aree scopriremmo che le proteine presenti nel polo apicale non sono presenti nel polo basale e viceversa. Questa differenziazione è dovuta principalmente alla compartimentalizzazione dei messaggeri e alla loro traduzione sito-specifica, e ciò fa sì che i messaggeri delle proteine apicali siano tradotti a ridosso della stessa e viceversa. A questo punto potrei aprire una parentesi interessante. Dovete immaginare queste proteine inserite nella membrana plasmatica, apicale o basale che sia, non come qualcosa di statico, ma come qualcosa di altamente dinamico. ciò che si avvicina di più a descrivere questo interessante mondo che è la membrana plasmatica è la descrizione a Mosaico fluido. La membrana fosfolipidica è costituita da fosfolipidi che sono appunto, lipidi. Lipidi molto spesso Poliinsaturi (quelli che sentiamo chiamare dai nutrizionisti omega-3, omega-6, ma che i biochimici chiamano in altro modo). Questo rende la membrana plasmatica simile (anche se NON identica) all’olio d’oliva, perchè anche questo è costituito principlamente da lipidi poliinsaturi, anche se ovviamente la membrana plasmatica è più rigida dell’olio perchè contiene anche del colesterolo. Comunque l’importante è che vi siate fatti un’idea. Benissimo, immaginate delle proteine di membrana “galleggiare” in una goccia d’olio (prendete con i guanti quello che sto dicendo). Queste proteine si muoveranno all’interno di essa, avranno un loro flusso, e una loro velocità. Che cosa impedisce allora ad una proteina apicale di finire nel polo opposto in seguito a questo movimento? essenzialmente il fatto che le cellule epiteliali sono legate tra loro da giunzioni molto strette (le Tight Junctions) costituite da proteine di membrana anch’esse. Queste proteine di membrana sono però al contrario delle altre fisse nella membrana, perchè connesse al citoscheletro. Queste giunzioni separano fisicamente i due poli cellulari, impedendo alle proteine di spostarsi troppo. Formano una barriera fisica al moto delle proteine! Tutto questo è assolutamente meraviglioso!
Nel neurone il discorso è ancora più complicato. Il neurone è una cella dalla morfologia particolare, con un corpo cellulare contenente il nucleo e altri organuli chiamato Soma, una lunga e sottile propaggine chiamata assone, responsabile della trasmissione degli impulsi nervosi, e un albero dendritico più o meno ramificato responsabile della ricezione degli impulsi nervosi provenienti da fonti diverse.

Anche qui, la regione dendritica sarà molto diversa dalla regione assonica in termini di funzione e in termini di proteine. I dendriti hanno bisogno di determinate proteine per funzionare (recettori per i neurotrasmettitori, canali ionici, proteine strutturali specifiche, ecc ecc) mentre gli assoni ne necessitano di altre. Se ipotizzassimo un modello in cui gli RNA messaggeri vengano distribuiti uniformemente all’interno del neurone sarebbe un gran caos: l’assone si ritroverebbe tra i piedi proteine dendritiche e del soma, i dendriti si ritroverebbero in mezzo alle scatole proteine assoniche, che per svolgere la loro funzione dovrebbero poi rispettivamente migrare nel sito corretto. Insomma, poco pratico perchè l’evoluzione lo lasciasse passare indenne. Le cose stanno in un altro modo. Gli RNA messaggeri una volta sintetizzati ed esportati nel citoplasma vengono indirizzati come fossero raccomandate nei rispettivi distretti cellulari: assone, dendriti, e soma. Qui vengono smistati e tradotti da ribosomi localizzati in questi luoghi specifici. Questo modello ha diversi vantaggi: il primo è l’ordine, ciascun distretto riceve i messaggeri di cui ha bisogno; il secondo è l’economia, immaginate quanto tempo ed energia la cellula dovrebbe spendere nel reindirizzare poi ciascuna proteina nel luogo corretto; il terzo è la possibilità di essere in qualche modo indipendenti. Dobbiamo vedere il neurone come una repubblica federale: la capitale è il nucleo, che sintetizza i messaggeri, i quali vengono inviati dove servono e qui vengono tradotti. Dovete immaginare poi che da ciascun messaggero possono essere sintetizzate n proteine identiche, dando così una certa autonomia locale. Anche qui potrete domandarvi: ma una volta inserite nella membrana del neurone, cosa impedisce ad esempio ai recettori dei neurotrasmettitori di andarsene a spasso? Qui non abbiamo le tight Junctions epiteliali (anche se c’è qualcosa di molto simile, non so se sapete, ma neuroni e cellule epiteliali derivano dallo stesso foglietto embrionale: l’ectoderma), ma le proteine che devono rimanere fisse sono bloccate attraverso legami con il citoscheletro.
A questo punto, se quanto ho detto fino adesso è chiaro e vi ha un minimo interessati (cosa che spero, anche perchè non credo che sareste arrivati a leggere fino a qui se non vi interessasse), vi sarete chiesti: e come fa un messaggero o chi per esso a sapere dove deve essere indirizzato? C’è forse scritto sopra il destinatario? C’è una proteina che svolge un ruolo da postino? e anche una volta che si sappia la destinazione, come diavolo fa ad arrivarci?
La risposta, come la domanda, è molto interessante. Dobbiamo sapere che un messaggero maturo è costituito dalla sequenza codificante, quella che verrà tradotta in proteina, compresa tra un codone di inizio ed uno di stop. Oltre alla sequenza codificante possiede a monte e a valle di essa delle sequenze che non vengono tradotte in proteina, che vengono chiamate sequenze UTRs (UnTranslated Regions), e distinguiamo un 5′-UTR, che è appunto nella regione 5′ del messaggero, ed un 3′UTR al 3′. Queste regioni sono molto importanti, e servono come piattaforme per il reclutamento di proteine (che vi riconoscono specifiche sequenze) coinvolte nell’esportazione, nella traduzione, nella longevità e nella localizzazione del messaggero stesso. La maggiorparte delle sequenze regolatrici coinvolte nella localizzazione del messaggero sono contenute nel 3′UTR. A queste sequenze, appunto, si legano numerosi fattori che, interagendo con proteine trasportatrici, trasportano i messageri in determinate direzioni. Le proteine trasportatrici sono delle proteine che appartengono a famiglie come le Chinesine, Dineine e sono coinvolte nel trasporto intracellulare di macromolecole come altre proteine, vescicole, messaggeri ecc. A loro volta queste proteine trasportatrici utilizzano dei binari preferenziali per muoversi:i Microtubuli e i filamenti di Actina. Sono dei filamenti proteici che costituiscono il Citoscheletro, e tra le altre cose fungono da binari per il trasporto intracellulare di materiale. Ciascuna proteina motrice è responsabile di un Trasporto unidirezionale. E’ stato dimostrato come i microtubuli presenti nell’assone siano utilizzati da queste proteine motrici per il trasprorto di: messaggeri, ribosomi, e neurotrasmettitori dal soma all’estremità assonale. Le velocità di questo Trasporto possono andare dalle poche decine alle diverse centinaia di mm al giorno. Quindi grazie a specifiche sequenze nel 3′UTR dei messaggeri, a proteine che riconoscono queste sequenze e alle proteine motrici, possiamo immaginare il traffico all’interno della cellula. E’ stato visto che messaggeri identici, che differivano nel 3′UTR a causa di splicing alternativo, avevano localizzazioni diverse all’interno del neurone. E sostituire il 3′UTR di un messaggero con un altro cambia la localizzazione del messaggero stesso. Quindi c’è un codice che dobbiamo ancora comprendere fino in fondo che fa sì che la cellula riconosca e indirizzi i messaggeri là dove è richiesta la proteina in maniera specifica ed efficiente. Un altro tassello per comprendere meglio la biologia cellulare che è sempre molto complessa, sfaccettata e incredibilmente interessante.
Come sempre, fate domande e se avete dubbi chiedete!

Articoli in merito:
“Subcellular mRNA localization in Animal Cells and why it matters” Holt and Bullock, Science 27 Novembre 2009, Vol 326

“To localize or not to localize: mRNA fate is in 3′UTR ends” Catia Andreassi and Antonella Riccio, Trends in Cell Biology Vol.19 No.9, 2009

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Professione proofreader

27 marzo 2011 in dendrite by Manuel | No comments

Dicesi proofeader un correttore di bozze. Una persona cioè che rilegge i testi da pubblicare per individuare gli errori e correggerli. Gli errori si sa è impossibile eliminarli completamente, ma un buon correttore di bozze ne individua ed elimina la maggiorparte, rendendo i rimanenti trascurabili e il testo leggibile.
Ciò a cui voglio arrivare con questa introduzione probabilmente l’avrete già capito. Sono un tipo prevedibile, non c’è dubbio! Ciò che noi chiamiamo correttore di bozze è una perfetta analogia con la correzione degli errori a livello del DNA. Abbiamo in entrambi i casi una montagna di informazioni che deve essere preservata affinchè sia funzionale. Durante ogni processo di Replicazione del DNA (che precede ogni divisione cellulare), ma anche durante la normale vita cellulare il DNA, i nostri geni, possono subire delle alterazioni. Nel primo caso infatti, gli enzimi che sintetizzano il nuovo filamento di DNA a partire da quello vecchio, con una frequenza variabile, possono copiare in modo errato il DNA, introducendo così una mutazione. Accoppiare una A con una G, induce una mutazione. Nel secondo caso, invece, eventi esterni come l’esposizione ad agenti cancerogeni (che sono mutàgeni, ovvero inducono mutazioni) oppure interni come la liberazione di Radicali liberi, possono danneggiare o mutare il DNA. Se questi errori non fossero individuati e corretti si svilupperebbe una instabilità genomica tale che la vita degli organismi sarebbe messa seriamente a rischio. Ovviamente durante l’evoluzione si sono selezionati numerosi geni che entrano a far parte dei cosiddetti: “Sistemi di riparazione del DNA”. Questi sistemi sono costituiti da enzimi in grado di riconoscere le anomalie e nella maggiorparte dei casi di correggerle. Esistono delle patologie ereditarie in cui alcuni geni che codificano per questi enzimi sono mutati e non funzionanti. I sfortunati soggetti affetti da queste malattie hanno un genoma più instabile rispetto alle persone normali, e più soggetto a mutazioni. Tutto ciò si traduce in un marcato aumento del rischio di sviluppare tumori in giovane età (Xeroderma Pigmentoso).
Addentriamoci maggiormente nell’argomento. In maniera molto schematica, possiamo dividere i sistemi di riparazione del DNA in base al meccanismo con cui l’acido nucleico viene riparato.
Immaginamo di avere una lesione al DNA molto seria, e per lesione al DNA intendo, ad esempio, nucleotidi ai quali sono legati covalentemente dei gruppi chimici. E’ questo il caso, ad esempio, dell’esposizione ad alcuni agenti cancerogeni detti (Agenti Alchilanti, che trasferiscono sui nucletodi gruppi alchilici, modificandoli. In questo caso la via preferenziale è l’escissione dei nucleotidi alterati, attraverso il taglio del filamento danneggiato ai lati della lesione, l’eliminazione del frammento escisso e la sintesi grazie all’intervento della DNA polimerasi della regione mancante usando come stampo il filamento non danneggiato. Questo meccansimo viene definito Nucleotide Excision Repair, per gli amici NER. Si ritiene che il NER sia utilizzato nei casi in cui, durante la trascrizione di un gene, la RNA polimerasi si blocchi a causa dell’errore. In questo caso l’errore viene riconosciuto e corretto dando la precedenza ai geni che vengono trascritti rispetto a quelli che sono silenziati.
Parliamo invece di BER, ovvero Base Excision Repair, quando non si tratta di eliminare l’intero nucleotide, o sequenza di nucleotidi, come nel NER, ma soltanto la base azotata. Infatti, molte volte ad essere alterata nel DNA è proprio la base azotata (A, T, G, C). Ad esempio, spontaneamente la Citosina può convertirsi in Uracile, attraverso la perdita di un gruppo amminico. L’uracile non è una base consentita nel DNA, pertanto in questo caso il BER interviene, elimina l’uracile e, dato il fatto che l’uracile si trovava accoppiato con una guanina viene rimpiazzato con l’appropriata citosina. Deve essere questo il motivo per cui l’uracile è stato sotituito dalla Timina nel DNA, perchè c’era il pericolo della conversione spontanea della citosina. Tuttavia, bisogna sottolineare che spesso nel DNA la citosina si trova metilata sul carbonio 5, in 5 metilcitosina per ragioni epigenetiche. Queste metilazioni sono indispendabili per la regolazione della trascrizione. La deaminazione della 5 metilcitosina dà la timina, che essendo una base naturale del DNA causa possibile confusione nei sistemi di riparazione. Un’altra modificazione spontanea delle basi azotate è quella che dall’Adenina porta all’Ipoxantina, sempre attraverso la deaminazione. L’ipoxantina non è una base comune (è un intermedio metabolico) e pertanto viene riconosciuta come errata.
Altre alterazioni possono colpire le basi azotate, e venire corrette mediante il BER.
Quello che vorrei fosse chiaro però, è che non c’è una distinzione netta tra mutazioni riparabili dal NER e quelle riparabili dal BER. C’è una certa sovrapposizione che crea ridondanza. Questo ovviamente è un meccansimo di sicurezza in più, nel caso fosse danneggiato un sistema.
Poi abbiamo il cosiddetto Mismatch Repair (MMR). Ovvero riparazione degli accoppiamenti sbagliati. La DNA polimerasi, come dicevo, non è un enzima perfetto e talvolta durante il processo di duplicazione del DNA può accoppiare due nucleotidi sbagliati. Così come negli altri casi, questa alterazione viene avvertita dai sistemi di riparazione, e viene così eliminato il nucleotide errato. Benissimo. Come distinguiamo il nucleotide errato da quello corretto? Se ci troviamo di fronte una A con una G, come fa l’enzima a sapere se è la G che è stata accoppiata alla A o viceversa? A questo proposito viene in soccorso il fatto che normalmente il filamento di DNA “originale”, quello più vecchio insomma, è distinguibile da quello nuovo grazie a delle metilazioni a livello delle Adenine in particolari sequenze come GATC. Questa sequenza ha una frequenza di circa 1/256, e l’enzima che opera questa metilazione è chiamato Dam metilasi. Il filamento appena sintetizzato ci impiega un po’ di tempo prima di essere metilato, per cui c’è un intervallo di tempo nel quale i sistemi di riparazione possono distinguerlo. A volte le cose più semplici sono quelle più vincenti.
Abbiamo visto come il DNA sia una molecola soggetta a mutazioni. Queste mutazioni possono essere spontanee (come la deaminazione della citosina in uracile), indotte (come l’alchilazione delle basi azotate), oppure dovute alla replicazione. Abbiamo anche visto come numerosi enzimi riconoscano queste alterazioni e le riparino. Si stima che durante una divisione cellulare la frequenza di mutazione si aggiri attorno a 1.4E-10 per nucleotide/cellula/divisione, che è un valore virtualmente nullo.
Immaginiamo però una situazione più grave. Immaginiamo un caso in cui entrambi i filamenti della doppia elica sono danneggiati. Magari perchè sono rotti (DSB, double strand breaking). Casi simili possono essere dovuti all’esposizione di radiazioni elettromagnetiche come raggi UV o peggio, raggi gamma. In questo caso non abbiamo un filamento a cui affidarci per la riparazione. In questo caso abbiamo due vie. La prima, poco accurata e più semplice, si chiama Non Homologous End Joinnig (NHEJ), e consiste nel riunire i due filamenti rotti. Questo sistema non è molto accurato, e nel processo possono perdersi diversi nucleotidi, causando comunque mutazioni. Il secondo caso, invece, abbiamo la ricombinazione genetica. Ho già parlato diverse volte della ricombinazione. E’ un processo che avviene nei gameti, e si chiama crossing over, ma anche nelle cellule immunitarie e si chiama ricombinazione somatica. È un processo che prevede lo scambio di due o più segmenti genici. Può avvenire all’interno dello stesso cromosoma o avvenire tra due cromosomi diversi. In questo caso, in breve, si cerca di riparare al danno andando a “copiare” la stessa regione danneggiata sul rispettivo cromosoma omologo, che si spera non sia stato danneggiato anch’esso. Questo è uno dei vantaggi di essere diploidi, avere il Genoma in doppia copia!
Nel caso in cui il danno al DNA fosse irreparabile, molto probabilmente la cellula andrà incontro ad apoptosi, ovvero morte cellulare programmata. Questa è l’ultima difesa che abbiamo contro lo sviluppo di cellule mutate potenzialmente tumorali.

Spero che l’argomento sia stato interessante. Se avete domande, o notate errori usate i commenti!

Alla prossima!

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L’influenza e la sua diffusione

19 marzo 2011 in dendrite by Manuel | 2 comments

L’influenza viene considerata da molti un male di stagione passeggero, poco interessante e molto fastidioso. Di queste tre caratteristiche, solo una trovo sia corretta: l’ultima. L’influenza non è solo un male di stagione, l’influenza può trasformarsi in una vera e propria pandemia, diffondendosi in tutto il mondo con velocità spaventose. Se pensiamo alla pandemia più famosa, quella della Spagnola, che nel periodo 1918-1919 uccise più di 50 milioni di persone in tutto il mondo, ci rendiamo conto che l’influenza è molto più che un banale malessere. Questo tuttavia non significa che ogni pandemia rischi di causare milioni di morti. Ma ogni cosa a suo tempo.
I responsabili sono virus appartenenti alla famiglia Orthomyxoviridae. A questa famiglia appertengono i Virus dell’influenza A (di cui ci occuperemo), i virus dell’influenza B e C. Tra tutti, quelli dell’influenza A sono i più diffusi e i più importanti dal punto di vista umano. Per cui sarà di loro che parlerò (anche perchè altrimenti verrebbe fuori un articolo spropositato).
Gli Orthomyxovirus sono una famiglia di Virus con un genoma di RNA a singolo filamento. Hanno un genoma segmentato, ovvero suddiviso in diversi frammenti ciascuno dei quali codifica per una proteina (alcuni per due). In tutto i Virus dell’influenza A hanno 8 segmenti genomici. Questa caratteristica è molto importante e il perchè lo vedremo dopo.
Un’altra cosa da dire dei virus dell’influenza A è che sono virus prevalentemente aviari, ovvero sono in grado di infettare gli uccelli (che rappresentano quindi il maggiore serbatoio di infezione), ed alcuni di questi possono infettare anche altri animali, come l’uomo, i maiali, i cavalli e così via. Quindi non sono specie-specifici, ma hanno uno spettro d’ospite (Host range) ampio.
In ogni caso sono virus che infettano le cellule epiteliali delle vie respiratorie, e di per loro stessi non sono nemmeno tanto citopatici, ovvero non danneggiano gravemente il tessuto, quel che ci fa sentire male, durante l’influenza, è infatti la risposta immunitaria che il nostro organismo attiva nei confronti del virus, un paradosso, vero?
Ma entriamo nel vivo della questione. La capacità del virus di infettare le cellule epiteliali del sistema respiratorio non è casuale. Infatti, il virus possiede una proteina chiamata Emoagglutinina (abbreviato HA), chiamata così per la sua capacità di far condensare (agglutinare) gli eritrociti fra di loro. Questa proteina, costituita dall’associazione di tre subunità proteiche identiche, è fondamentale per il virus perchè è ciò che gli permette di entrare nelle cellule ospiti e di iniziare la replicazione. Queste cellule, infatti, presentano numerose proteine di membrana glicosilate (Glicoproteine), ovvero associate con carboidrati (glicidi). Una molecola molto diffusa in questi carboidrati è l’acido sialico o neuroamminico che viene riconosciuto dalla HA in situazoni particolari, e questo legame consente al Virus di penetrare nella cellula. il meccansimo che sta alla base di questo processo è complicato, per cui lo salto, ma se voleste saperne di più chiedete pure nei commenti.
Tutti i virus, per entrare all’interno delle cellule (tappa necessaria per il processo di infezione), hanno evoluto dei meccanismi simili: possiedono cioè una proteina (o più proteine) che viene riconosciuta specificamente da proteine di membrana cellulari. Il legame specifico (simile a quello di un Recettore col suo ligando) consente al Virus di entrare. Vi starete chiedendo come mai la selezione naturale “abbia selezionato” dei geni dell’ospite che codificano per proteine che sono utili ai virus per potersi replicare. La risposta più plausibile tiene conto del fatto che queste proteine sono necessarie alla sopravvivenza della cellula stessa, pertanto sono proteine altamente conservate e questo ha permesso ai virus di adattarsi.
Una volta entrato nella cellula, il virus inizia il suo ciclo replicativo, che porterà alla formzione di molte copie del virus originario, che non appena sono pronte fuoriescono dalla cellula ospite per infettare a loro volta altre cellule. Il processo di fuoriuscita del virus è reso possibile da un’altra proteina virale la Neuroaminidasi (Abbreviato NA). Questa proteina, costituita dall’associazione di quattro subunità identiche, è un enzima che, come dice il nome, scinde il legame che lega l’acido neuroaminico (o sialico) alla catena di carboidrati associata alle proteine cellulari. Questo è fondamentale affinchè il virus possa fuoriuscire liberamente dalla cellula per andare ad infettarne altre senza che la propria HA lo blocchi legandosi all’acido sialico della cellula. Senza la NA il virus si replica correttamente, ma la sua progenie non è infettiva, perchè non riesce a staccarsi dalla superficie cellulare.
Esistono dei farmaci, che sono delle molecole simili all’acido sialico (in gergo si chiamano analoghi) che funzionano legandosi irreversibilmente alla NA del virus, impedendo che questa agisca sull’acido sialico vero. In questo modo la NA risulta inibita e il virus perde la sua infettività; in commercio ci sono l’Oseltamivir e lo Zanamivir. Sono dei farmaci antiinfluenzali veri e propri, che ostacolano il virus e non i sintomi influenzali come invece fanno i farmaci che normalmente prendiamo (i FANS).
Grazie all’analisi dei rispettivi geni, sono stati individuati 16 tipi di HA e nove tipi di NA. In base a che HA e NA ciascun virus possiede, distinguiamo i diversi sierotipi del virus dell’influenza A, che vengono indicati con la sigla HxNy, dove H indica l’emoagglutinina e x va da 1 a 16, mentre N indica la neuroaminidasi e y varia da 1 a 9. Per cui avremo il sierotipo H1N1, H1N5, H3N2 et coetera.
La cosa che deve essere chiara è che la proteina HA è il fattore che determina l’ospite o gli ospiti che il virus è in grado di infettare. Nonostante tutte le HA riconoscano l’acido sialico e di acido sialico ce ne sia un solo tipo, quello che cambia da un organismo all’altro è il modo con cui l’acido sialico si lega al resto della catena glicidica. Senza scendere nel dettaglio biochimico, è questo legame che viene riconosciuto dalla HA. Per cui, in base all’HA il virus sarà in grado di infettare ospiti diversi, fermo restando che tutti e 16 tipi di HA permettono al virus di infettare gli uccelli. Questa tabella esemplifica quello che ho detto:

Ad esempio, Il virus che causò la Spagnola, che come ho detto all’inizio causò oltre 50 milioni di vittime, era un virus originatosi da un ceppo aviario H1N1. Alcuni ceppi che circolano tutt’ora tra gli esseri umani derivano da quello stesso virus, ma hanno una virulenza molto meno accentuata. Una caratteristica di questa pandemia, oltre al fatto che il virus risultò da un adattamento all’uomo di un virus aviario, è che aveva una mortalità elevata nelle fascia d’età compresa tra i 15 e i 40 anni, cosa insolita, visto che solitamente questa è la fascia di età che ne risente meno.
Cosa rende possibile il passaggio del virus da una specie all’altra? Perchè mai un virus che infetta gli uccelli dovrebbe improvvisamente infettare anche l’uomo? Questo è un argomento molto interessante. Il passaggio da una specie all’altra deve implicare il cambiamento di HA. Questo cambiamento può avvenire tramite mutazione puntiforme del gene (Antigenic Drift), oppure tramite riassortimento genetico (Antigenic Shift).
Il primo fenomeno è dovuto alla relativa poca precisione che caratterizza la sintesi delle copie del genoma virale durante il ciclo replicativo. La RNA polimerasi virale ha un tasso di errore che varia da 1×10-3 a 8×10-3 mutazioni per posizione per anno. Questo rende abbastanza facile l’insorgenza di mutazioni nei geni virali. Se avviene un cambio amminoacidico nella HA tale per cui la proteina riconosce un tipo diverso di legame, il virus potrà fare il cosiddetto salto di specie.
L’antigenic Shift è invece un meccanismo più interessante. Ho accennato all’inizio che il genoma virale è costituito da 8 segmenti genomici, ciascuno codificante una proteina (alcuni due). Ci sarà quindi un segmento codificante la HA e un altro la NA. Questi segmenti sono unità genomiche discrete che, nella giusta combinazione, formeranno un genoma completo funzionante. Poichè il virus può contenere invariabilmente 8 frammenti, se nel processo di formazione di un virus, che è un automatico assemblamento di proteine e geni virali, viene incorporata una combinazione errata, il virus non sarà funzionante. Cosa succede se due ceppi di virus influenzali diversi infettano uno stesso organismo? Succede che c’è la possibilità che all’interno di questo organismo possa venire a formarsi un ceppo virale completamente nuovo dato dall riassortimento dei segmenti genici dei due virus. Non è una cosa campata per aria. E’ successo e succederà. Solitamente gli organismi dove avvengono questi riassortimenti sono organismi che possono essere infettati da diversi sierotipi, in particolar modo i maiali.
Qual è l’importanza di questo evento? Primo che che si creano nuovi ceppi virali, e secondo, in conseguenza di questo, che questo nuovo ceppo di virus potrebbe infettare organismi nuovi, come l’uomo, senza che il sistema immunitario abbia una minima esperienza al riguardo.
Un esempio lampante è il caso della cosiddetta influenza aviaria, di cui tanto si è sentito parlare negli anni scorsi.
L’influenza aviaria è, come dice il nome, una pandemia di influenza che si diffonde tra gli uccelli. Nella storia se ne sono avute diverse, di queste pandemie, ma nel 2003 nel sud est asiatico da un evento multiplo di antigenic shift si è venuto a creare un nuovo ceppo H5N1 particolarmente patogeno per gli uccelli, causando la morte di milioni di esemplari (polli, anatre, uccelli selvatici) in più di sessanta paesi e al 2010 ha causato 489 casi umani e 289 morti. Questo virus quindi si diffonde soprattutto tra gli uccelli, causandone la morte, e in maniera molto meno efficiente si diffonde tra animale e uomo e tra uomo ed uomo. Questo significa che nonostante la sua altissima patogenicità questo virus non si è ancora perfettamente adattato all’uomo (e per fortuna voglio aggiungere). Ciò non toglie che in futuro possa avvenire un altro riassortimento che lo renda adatto all’essere umano causando una vera e propria pandemia.
Un altro caso è quello dell’influenza suina del 2009. Questo ceppo H1N1 fortunatamente poco patogeno che dal maiale è in grado di passare all’uomo è derivato da un riassortimento avvenuto nel maiale di due ceppi preesistenti: l’americano H1N2 e l’eurasiatico H1N1. Questi virus sono dei discendenti del virus H1N1 responsabile della pandemia di spagnola. Questo ceppo si stima abbia causato più di 8 mila morti nel mondo, risultando assimilabile con quello stagionale.
Non possiamo prevedere le future pandemie e anche quando avvengono possiamo fare relativamente poco per contrastarle (a parte mettere a punto dei vaccini), questo ci fa capire come nonostante si abbiano conoscenze molto approfondite dei virus abbiamo ancora relativamente pochi mezzi per contrastarli.
Con questo non voglio mettere paura a nessuno, ma solo informare come la realtà sia sempre più complessa di quanto crediamo.
Spero di essere stato interessante ed esaustivo. Se avete dubbi, domande, se notate errori o imprecisioni come sempre dico usate i commenti!

Alla prossima.

Bibliografia:

“Influenza: The Once and Future Pandemic” di Jeffery K. Taubenberger, David M. Morens. Public Health Reports/ 2010 Supplement 3/Volume 125

“Influenza Hemagglutinin and Neuraminidase Membrane Glycoproteins” di Steven J. Gamblin and John J. Skehel. JOURNAL OF BIOLOGICAL CHEMISTRY, SEPTEMBER 10, 2010

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