Topi

Decisamente non siamo sul ring, ma in un laboratorio. Non ci sono due mastodontici contendenti pronti a darsele di santa ragione, ma un ricercatore e il suo stuolo di topi da laboratorio. Il Knock-Out (KO) è una tecnica sperimentale molto interessante e utile e permette di inattivare o sostituire singoli geni nei cromosomi con una precisione chirurgica.
Volete sapere che funzione abbia un gene in un particolare processo? Cosa c’è di meglio che toglierlo e vedere cosa succede? E’ possibile fare un knock out su singole cellule, ma è possibile anche creare degli organismi fatti e finiti (quando va bene) knock-out.
Per comprendere bene questa tecnica è necessario conoscere la ricombinazione e approfitto di questa occasione per parlarne un po’.
La ricombinazione è un processo che prevede lo scambio di due segmenti genici. Può avvenire all’interno dello stesso cromosoma o avvenire tra due cromosomi diversi. La ricombinazione è uno dei meccanismi attraverso il quale si forma la variabilità genetica. Uno dei più importanti eventi di ricombinazione avviene durante la meiosi (quando cioè i progenitori delle cellule germinali si dividono dando origine ai gameti); in questo caso viene anche chiamata crossing over ed è il meccanismo con il quale segmenti di DNA vengono scambiati tra due cromosomi omologhi. Questo è per creare gameti con un genotipo diverso da quello delle cellule di partenza. Ricombinazioni di questo tipo sono dette ricombinazioni omologhe, perchè sono omologhe le sequenze che si scambiano. Cosa vuol dire? Vuol dire che un allele del gene A sul cromosoma 10 paterno viene scambiato con l’altro allele (che potrebbe anche essere lo stesso) del gene A sul cromosoma 10 materno (ricordo che abbiamo due copie del nostro patrimonio genetico, uno di origine paterna e uno di origine materna). In questo modo è come avere due mazzi di carte e mischiarli ogni volta in modo diverso, otteniamo combinazioni diverse ogni volta. Esiste anche una ricombinazione non omologa, che prevede lo scambio tra due segmenti di DNA casuali.
Apro una digressione che esula un po’ dall’argomento principale, ma è decisamente interessante. La metto in corsivo così la potete saltare se volete, visto che non è indispensabile per capire il resto del post.

I primi importanti studi sulla ricombinazione genetica o crossing over vennero fatti all’inizio del secolo scorso da Morgan e colleghi. Loro lavoravano sui moscerini della frutta (Drosophila melanogaster) e fecero alcune fondamentali scoperte sulla frequenza di ricombinazione. La frequenza di ricombinazione è la frequenza con cui si verifica una ricombinazione tra due loci durante la meiosi e quindi la frequenza con cui si vengono a creare combinazioni di geni diverse da quelle di partenza. In parole povere la frequenza con cui due geni vengono separati durante la ricombinazione.
Per fare un esempio, due geni presenti su cromosomi diversi sono indipendenti l’uno dall’altro e vengono ereditati indipendentemente. Per cui due individui omozigoti con genotipo AABB e aabb (dove A e a e B e b sono due alleli rispettivamente del gene A e B localizzati su due cromosomi differenti) producono gameti AB e ab. Se li incrociamo avremo una progenie AaBb la quale a sua volta produrrà dei gameti AB, aB, Ab e ab con la frequenza del 25% ciascuno. Questo perchè i due geni sono indipendenti, vengono ereditati dalla progenie indipendentemente, per cui per calcolare le frequenze attese basterà usare la legge degli eventi indipendenti (la probabilità che si verifichi un evento A moltiplicata la probabilità che si verifichi un evento B). In questo caso la frequenza di ricombinazione è del 50% perchè su quattro combinazioni della progenie (AB, Ab, aB, ab) ben 2 su 4 sono diverse da quelle dei genitori di partenza (Ab e aB) e quindi nel 50% dei casi si è verificata la ricombinazione tra quei loci.
Se prendiamo due geni C e D localizzati sullo stesso cromosoma,potremmo non avere gli stessi risultati perchè se sono sufficientemente vicini possono essere ereditati in blocco e pertanto non siamo più nel caso degli eventi indipendenti. In questo caso la frequenza di ricombinazione sarebbe più bassa del 50%.
Questo ultimo punto sarà più chiaro tra poco. Bene, Morgan e colleghi osservarono che nei moscerini della frutta la frequenza di ricombinazione tra una coppia di geni rimaneva sempre costante durante tutte le generazioni e le frequenze di ricombinazione tra coppie di geni ogni volta diverse erano diverse tra loro. Questo voleva dire due cose: che la distanza tra due geni era sempre costante e che la frequenza di ricombinazione poteva essere usata come misura della distanza tra due geni.
Mi spiego meglio: più due geni sono vicini sullo stesso cromosoma, più la frequenza di ricombinazione sarà bassa (è meno probabile che quei geni vengano separati durante il crossing over e che diano origine a combinazione diverse, è più probabile che vengano ereditati insieme), più due geni sono distanti sullo stesso cromosoma più la frequenza di ricombinazione sarà alta, il caso estremo è quando i geni sono su due cromosomi diversi (è più probabile che quei due geni vengano separati). Per tornare al punto di prima, più due geni sono vicini maggiore è la possibilità che vengano ereditati in blocco e quindi le loro distribuzioni nella progenie non sono più eventi indipendenti.
Queste scoperte fecero venire in mente a Morgan di potere usare la frequenza di ricombinazione come misura della distanza tra due geni e in questo modo si iniziarono a fare mappe dettagliate sulla disposizione dei geni lungo i cromosomi. Viene ancora usata l’unità di misura del centimorgan che è la probabilità dell’1% che due loci vengano separati durante la ricombinazione ed equivale in media ad un milione di paia di basi.

Mi rendo conto che è stata una digressione lunga e forse non troppo semplice da capire, non era prevista nella mia idea originale di Post; è stata un’evoluzione spontanea :)… se non vi fosse chiaro  fate pure domande!

Ma ritorniamo al nostro punto principale, il Knock-out.  Per generare un animale Knock-out, quindi privati di un gene, è necessario fare diverse cose. D’ora in avanti darò per scontato che l’animale di cui si parla è il topo, che è quello che più frequentemente viene utilizzato.
Allora, per eliminare un gene è necessario prima di tutto preparare in laboratorio una versione dello stesso ma con un difetto che lo renda inattivo. Il modo più facile è introdurre all’interno del gene un altro gene che gli dia una qualche proprietà, come una resistenza ad un antibiotico in modo poi da poter effetturare una selezione positiva. Ai lati di questo costrutto si inseriscono due regioni omologhe a quelle del gene che devo sostituire per rendere possibile la ricombinazione omologa, per far sì che quel gene modificato si vada a sostituire al gene voluto e non in una regione casuale del genoma. Infine è buona norma inserire al di fuori delle sequenze di ricombinazione un gene letale per la selezione negativa. Per chiarire ho fatto un semplice schema (è ridicolo, lo so):

Legenda:

Rosso: costrutto
Blu: sequenze di ricombinazione
Giallo: gene originale
Verde: Gene per la resistenza agli antibiotici (selezione positiva)
Nero: gene letale (selezione negativa)

Questo costrutto viene inserito in diverse cellule staminali embrionali, prelevate da una blastocisti di topo, all’interno delle quali, se tutto va bene, avremo la ricombinazione del gene modificato con il gene originale e l’eliminazione di quest’ultimo. Alla fine il risultato sarà che, le cellule che hanno avuto la ricombinazione omolga saranno resistenti all’antibiotico, quelle che non hanno avuto la ricombinazione moriranno se esposte all’antibiotico e quelle che hanno avuto una ricombinazione casuale, hanno incorporato anche il gene letale e moriranno per questo. Con il gene per la selezione positiva e quello per la selezione negativa abbiamo quindi isolato le cellule che hanno avuto la ricombinazione omologa (approssimativamente 1 su 10 alla quarta)

Le cellule sopravvissute però sono eterozigoti, per chè la ricombinazione avviene solo su uno dei due alleli.
Queste cellule vengono fatte proliferare in vitro e vengono impiantate in un embrione di topo ricevente con alcune caratteristiche genetiche appositamente diverse, come ad esempio il colore del pelo. I topi che nasceranno saranno dei topi chimerici, con caratteristiche sia del ricevente, sia del donatore.
Quello che a questo punto si fa è incrociare un topo chimerico con un  topo albino  Si otterrà una progenie mista, distinguibile dal colore del pelo. I topi col pelo dello stesso colore del topo da cui si sono ricavate le cellule staminali che sono state modificate geneticamente saranno i topi Knock out. Ma sono eterozigoti, ricordate? A noi servono gli omozigoti. Quindi si incrociano due eterozigoti e si otterranno, tra gli altri, dei topi omozigoti per il gene Knock-out.
A volte, però, qualcosa va storto, e non abbiamo nessun animale Knock-out omozigote. E’ evidente che in questo caso, il gene che è stato tolto era fondamentale per l’animale e che quindi quelli privi di quel gene non sono sopravvissuti durante lo svliluppo embrionale. A volte non sopravvivono nemmeno gli eterozigoti.
Ci sono degli escamotage per ovviare a questo inconveniente, come i Knock-out condizionali. In questo caso è possibile far nascere e crescere i topi, e solo secondariamente inattivare il gene (cre-lox). E’ possibile fare anche un Kncok out tessuto specifico, ovvero inattivare il gene solo in un tessuto (sistema nervoso, miocardio, ecc ecc).

Come avete visto, a parte la digressione iniziale, fare un knock out non è così semplice. Gli imprevisti sono sempre alle porte e richiede anche abbastanza tempo (diverse generazioni di topo). Ma è assolutamente indispensabile per la comprensione di molti processi.
Finalmente (per voi) ho finito questo interminabile poema. Come sempre sono aperto alle critiche. Se notate errori ditemelo e se non capite chiedete! i commenti sono fatti per questo!

Un’ultima cosa, uno dei primi a sviluppare la tecnica del knock out è stato Mario Capecchi, un italiano premio nobel!!

Adios