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Vettori retrovirali: come e perchè

15 novembre 2011 in lente di barlow by Manuel | 2 comments

Ammetto che i retrovirus turbano la mia mente, come biologo molecolare mi sento profondamente attratto da loro (patogeni esclusi), basta vedere quanta attenzione ho loro dedicato! Sarà che ben l’8% del mio genoma in realtà è retrovirale? Ma se è per questo anche il vostro (vedere articolo precedente)!
Un vettore molecolare è un sistema per trasferire elementi genici (geni interi, frammenti di geni, elementi regolatori) in un sistema accettore compatibile. Gli esempi di vettori più semplici che abbiamo sono i plasmidi batterici, molecole di DNA circolare (che si trovano normalmente in natura come elementi extracromosomici nei batteri, appunto) all’interno delle quali possiamo inserire dei geni di nostro interesse, dopodichè non dobbiamo “far altro” che introdurre questi plasmidi “pieni” all’interno dei batteri scelti (processo detto trasformazione) e in questo modo i batteri, che faremo proliferare, produrranno numerose copie di questo plasmide e se è il caso esprimeranno anche la proteina relativa (per approfondire leggere il mio vecchio articolo cloning a gene)!
I vettori retrovirali hanno la stessa filosofia di base, ma sono decisamente più sofisticati e raffinati. Ma andiamo con ordine! Ovviamente un vettore retrovirale si basa sulla biologia dei Retrovirus di cui, come ho già detto nell’articolo precedente, ho già parlato anche fin troppo (Qui e Qui e Qui), per cui non sto a rispiegare cosa sono e cosa fanno.

Quello che spiegherò invece è la struttura del genoma retrovirale; un retrovirus ha un genoma a RNA a singolo filamento. Alle estremità di questo filamento ci sono due sequenze terminali diverse, una sequenza terminale 5′ costituita da una regione chiamata R e una regione chiamata U5, e una sequenza terminale 3′, costituita da una sequenza chiamata U3 e una copia identica della sequenza R.

R-U5_________________(RNA a singolo filamento)_______________U3-R

Queste sequenze (R-U5 e U3-R) sono estremamente importanti sia nell’integrazione del genoma virale (retrotrascritto poi in DNA), sia nell’espressione dei geni virali da parte di fattori di trascrizione dell’ospite. Durante la retrotrascrizione, il processo col quale il Genoma virale di RNA a singolo filamento viene trasformato in un genoma a DNA a doppio filamento (leggere il post Retrovirus), vengono aggiunte dei pezzettini al genoma in costruzione, e queste sequenze sono rispettivamente la sequenza U3 al 5′ (prima della sequenza R) e di U5 al 3′, (dopo la sequenza R). In questo modo, quelle che nel genoma a RNA erano sequenze terminali diverse (R+U5 vs U3+R), ora sono diventate delle sequenze terminali identiche (U3-R-U5 e U3-R-U5) Queste sequenze sono chiamate LTR, Long terminal Repeats.

U3-R-U5_____________(DNA a doppio Filamento)______________U3-R-U5

All’interno del genoma, tra queste due LTR ci sono ovviamente i geni retrovirali. I tre geni più importanti sono chiamati Gag, env e pol, che codificano ciascuno per diverse proteine. Il gene gag codifica per le proteine del capside virale, Env codifica per le proteine dell’envelope e Pol codifca per proteine come la retrotrascrittasi, l’integrasi e la proteasi.
La trascrizione di questi geni inizia una volta che il Genoma a DNA si è integrato. I trascritti possono Monocistronici (ovvero contenere un solo gene) oppure policistronici. La maturazione delle proteine virali avviene poi attraverso la proteasi che dai precursori genera le proteine definitive.
Oltre a Gag, Pol e env, ci sono anche altri geni accessori che possono variare da retrovirus a retrovirus, e hanno il compito di facilitare l’operato del virus, molto famosa è, nell’HIV, la proteina Tat, codificata dal gene omonimo, che è un trans-attivatore, ovvero è una proteina che durante la trascrizione del genoma del virus integrato, si lega al trascritto nascente e permette di aumentare l’efficienza della trascrizione stessa consentendo la produzione di trascritti full-lenght, senza questa proteina il virus sarebbe in grado di sintetizzare solo messaggeri troppo corti.

Un vettore retrovirale sfrutta la capactà dei retrovirus di INFETTARE le cellule e di INTEGRARE il loro genoma in quello delle cellule ospiti. In questo modo possiamo trasferire e far esprimere geni che vogliamo ai nostri modelli sperimentali (linee cellulari, animali) in maniera permanente e stabile. Quello che ci serve prima di tutto è quindi il genoma di un retrovirus, all’interno di questo genoma che è solitamente lungo una decina di kilobasi, dobbiamo inserire il gene di interesse. I problemi sono 2, il primo è che la somma tra il genoma retrovirale e il gene di interesse non deve superare una soglia critica, perchè altrimenti il vettore non potrà essere inserito all’interno del virus (capside) stesso per motivi di spazio. Il secondo è che non possiamo lavorare con il genoma ad RNA. Per il primo problema si è fatto sì che si sviluppassero dei vettori retrovirali estremamente ridotti, ovvero contenenti soltanto le LTR terminali ed una sequenza molto importante chiamata di incapsidamento (spiegherò dopo il significato). In questo modo, avendo eliminato tutti i geni retrovirali, io posso inserire all’interno delle LTR il mio gene di interesse. Il secondo problema è stato aggirato lavorando su vettore retrovirale in DNA. Tra tutti i vettori retrovirali, i più diffusi sono quelli lentivirali (i lentivirus sono una sottoclasse dei retrovirus)

 

 

In questo Vettore retrovirale abbiamo le due sequenze LTR, e una sequenza Psi che è la sequenza di incapsidamento. Dopodichè abbiamo due geni, uno che codifica una proteina che conferisce resistenza all’ampicillina esterno alle LTR, e un altro che codifica una proteina che conferisce resistenza ad un altro antibiotico, la neomicina che è interno alle LTR e sotto un promotore specifico SV-40 (SV-40 è un promotore appartenente ad un virus delle scimmie, ma non un retrovirus). Che cosa servono questi due geni di resistenza antibiotica? Servono per selezionare. Per iniziare, devo trovare il sistema per inserire il gene di interesse nel vettore di cui vedete sopra un’immagine (esistono tantissimi tipi di vettori retrovirali, e lentivirali in particolar modo). Il modo tradizionale consiste nell’usare degli enzimi di restrizione. Un enzima di restrizione è un enzima che taglia un doppio filamento di DNA, riconoscendo una specifica sequenza. Se io taglio il mio vettore, con un enzima che riconosca una sequenza una sola volta, e che quindi faccia un solo taglio (Per fare questo c’è una mappa di restrizione che indica i diversi siti di taglio presenti sul vettore), e in particolar modo riconosca una sequenza presente nella regione chiamata MCS, io aprirò il mio vettore, lo renderò una molecola di DNA lineare. Il taglio deve generare preferibilmente delle sticky ends, in modo che, usando lo stesso enzima per il mio gene di interesse (facendo attenzione che non lo tagli in mezzo, ma solo alle estremità), Io potrò incastrare il mio gene di interesse all’interno del mio vettore linearizzato proprio perchè avranno le estremità complementari. Legando il mio gene al mio vettore, questo si ricircolarizzerà, generando una molecola di DNA circolare con dentro il mio gene. Il gene è inoltre stato inserito in mezzo alle due LTR retrovirali (perchè ho utilizzato un enzima che tagliasse nel MCS). Ci sono inoltre dei metodi per inserire il gene nella direzione giusta, in modo che sia sotto il controllo del giusto promotore retrovirale (clonaggio direzionale).
Dopodichè si utilizzano dei batteri, all’interno dei quali inseriamo il nostro vettore per aumentarne la quantità. Solo i batteri che hanno assunto il vettore saranno in grado di crescere in un terreno contenente ampicillina, in questo modo io seleziono esclusivamente i batteri che mi servono, quelli che hanno il vettore. La domanda che potreste fare è: ma se visto che ho due geni che danno la resistenza due antibiotici diversi, uno chiaramente per i batteri e l’altro per le cellule eucarioti, sono interscambiabili? Posso cioè utilizzare la neomicina per selezionare i batteri anzichè l’ampicillina? la risposta è no, perchè in questo caso il gene della resistenza alla neomicina è sotto un promotore specifico per le cellule eucarioti, e i batteri non lo leggerebbero, per cui i batteri non sono resistenti alla neomicina, mentre le cellule eucarioti non sono sensibili all’antibiotico ampicillina per cui la selezione invertita non funzionerebbe.
Una volta ottenute grandi quantità di vettore, devo passare allo step successivo. Ovvero creare il retrovirus che contenga come genoma il mio vettore che ho appena costruito. Per fare questo devo tenere conto di diverse cose. innanzitutto, il mio vettore retrovirale, che ho appena costruito da solo non è in grado di produrre nessun virus visto che gli mancano tutti i geni (che gli sono stati tolti per far spazio al gene di mio interesse). Pertanto devo utilizzare un sistema di vicariaggio, ovvero inserire artificilamente il mio vettore appena fatto in cellule apposta (trasfezione). Queste cellule sono chiamate cellule Helper, poichè portano al loro interno tutti i geni retrovirali necessari (gag, env, pol ecc) ma senza la sequenza di incapsidamento. Quindi le cellule helper sono in grado di fornire al mio vettore le proteine neccessarie a integrarsi e trascriversi, sono in grado fabbricare le proteine strutturali virali e quindi di fabbricare il corpo del virus all’interno del quale dovrà incapsidarsi il nostro vettore di interesse. A questo punto entra in gioco il secondo fattore, ovvero la sequenza di incapsidamento: mentre il vettore che contiene il gene di mio interesse contiene la sequenza di incapsidamento, quello che fornisce le proteine retrovirali no, pertanto è impossibile che si vengano a creare dei virus contenenti il vettore con gag env e pol, ma solo quello contenente il gene che voglio. Le cellule Helper sono ottenute infettando delle cellule con un retrovirus privato della sequenza psi; con i primi protocolli accadeva che durante il processo di produzione dei retrovirus, si generassero spontaneamente dei retrovirus replicazione competenti (al contrario di quelli che si volevano ottenere, dei virus replicazione-incompetenti); questa reversione spontanea era dovuta ad eventi di ricombinazione tra il vettore col gene di mio interesse e il vettore con i geni virali standard privato della sequenza psi. Per ovviare a questo problema, si iniziò a transfettare le cellule Helper con vettori separati: uno che codifica per i geni gag-pol, ed un secondo vettore che contiene invece il gene env. Il gene env è molto importante perchè codifica per le proteine di superficie, quelle dell’envelope, che sono le proteine con cui il virus riconosce le cellule e le infetta. Il gene env quindi detrmina la specificità (tropismo) del virus nei confronti dell’ospite. Oltre a questo accorgimento si iniziarono a togliere tutte le sequenze non indispensabili dai vettori helper, per ridurre la probabilità di ricombinazione.
Quindi alla fine della fiera, io inserisco il mio vettore retrovirale nelle cellule helper, e queste cellule helper dopo alcuni giorni di incubazione mi daranno numerose particelle virali contenenti il vettore di mio interesse, anche se sulla totatilità solo una percentuale sarà effettivamente attiva (alcune particelle potranno infatti essere vuote). Io quindi prelevo dal terreno di coltura di queste celluel helper i miei virus, e posso usarlo per infettare le mie cellule. Il virus che ho ottenuto, sarà quindi come stabilito, replicazione incompetente perchè il suo genoma non è in grado di produrre le proteine virali, questo fa sì che quando utilizzerò il virus appena prodotto per infettare le cellule designate, che non sono più cellule helper, ma cellule normali, si avrà soltanto il processo di infezione, di retrotrascrizione e di integrazione del genoma virale e non si avrà nessuna produzione di virus. Ovviamente le cellule da infettare devono essere compatibili con il virus ottenuto, e la compatibilità è data, come ho detto prima, dalle proteine dell’envelope.
Quindi, lo step finale è quello di utilizzare i virus prodotti per infettare le cellule, normalmente quello che si fa è di creare sia un controllo positivo che un controllo negativo. Il controllo positivo può essere un retrovirus contenete nel suo genoma il gene della GFP, in modo che questo renda facile la quantificazione dell’efficienza di infezione (in base al numero di cellule con la fluorescenza verde). Il controllo negativo è un vettore retrovirale vuoto, senza nessun gene inserito, questo serve a controllare gli effetti dell’integrazione casuale che il genoma retrovirale subisce. Inoltre, le cellule infettate col virus vengono fatte crescere in un terreno contenente neomicina (nel caso del vettore in figura), per selezionare solo le cellule che hanno integrato il vettore. Le cellule infettate quindi esprimeranno stabilmente il gene di mio interesse, e il vantaggio di usare vettori retrovirali è che l’efficienza di infezione è molto alta, molto più alta di qualsiasi altro metodo “gene-delivering”.

Ora, per finire, vorrei parlarvi delle apllicazioni pratiche di questo sistema. A cosa mi serve creare dei retrovirus per far esprimere geni di mio interesse? Beh, senz’altro a studiare gli effetti dell’espressione di uno o più geni in un sistema controllato. Ad esempio io trovo che in un particolare tipo di tumore ricorre una particolare mutazione in un gene specifico. Per dimostrare che questa mutazione sia o meno importante nella generazione del tumore, io posso utilizzare dei vettori retrovirali per infettare cellule che non esprimono quel gene con la forma mutata e con la forma standard e osservare le differenze di comportamento nelle cellule infettate.
Un altro campo di applicazione è la cosiddetta Gene-therapy, terapia genica, ovvero il tentativo di curare malattie attraverso l’espressione di geni estranei. Famoso è il caso del deficit di adenosina deaminasi (ADA-deficiency), una malattia genetica che causa una gravissima immunodeficienza congenita. Si è provato a prelevare le cellule staminali emopoietiche di bambini malati, e infettarle con un retrovirus contenente il gene dell’enzima ADA. Straordinariamente le cellule transgeniche, una volta reimmesse nel midollo osseo dei bambini, davano origine a cellule immunitarie funzionanti, eliminando così l’immunodeficienza. Questi sono rari casi di successo nei protocolli di terapia genica attualmente in corso. bisogna sottolineare come, essendo l’integrazione del virus casuale, questo possa rappresentare un rischio di mutagenesi-virus-indotta. Altre applicazioni consistono nell’utilizzare dei vettori retrovirali per far esprimere geni come l’insulina nei diabetici (in corso di sperimentazione), o di utilizzare questi vettori come “bombe” mirate a far suicidare le cellule tumorali (introducendo geni antiproliferativi come p53), il problema è quello di riuscire a costruire dei vettori specifici soltanto per le cellule tumorali.
Concludo con una nota sulla sicurezza in laboratorio durante la produzione di questi virus. Il pericolo maggiore per i ricercatori è quello ovviamente di infettarsi con il virus prodotto, questo ovviamente è tanto più possibile quanto più compatibile è il virus con l’essere umano. Per questo è obbligatorio seguire rigide preocedure di sicurezza (lavorare in laboratori attrezzati specificamente e adibiti apposta, lavorare sempre sotto cappa, indossare mascherina e indumenti protettivi ecc, buon senso)

Spero di non avervi annoiato! Se avete domande, usate i commenti!

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The enemy within

8 novembre 2011 in dendrite by Manuel | No comments

Il titolo non è mio, l’ho rubato da un editoriale pubblicato su Nature Medicine qualche tempo fa, mi piacerebbe illustrare bene l’argomento perchè è senz’altro interessante!
Attualmente, circa il 7-8% del nostro genoma è costituito da sequenze di chiara origine retrovirale. Credo sappiate tutti che cosa siano i retrovirus e che conosciate la loro importanza biologica, in ogni caso ho scritto qualche mese fa un articolo interamente dedicato a loro. La capacità di integrare sistematicamente il loro genoma (che da RNA viene retrotrascritto in DNA a doppio filamento) in quello della cellula ospite (grazie ad un ezima particolare chiamato Integrasi), con l’obiettivo di utilizzare i macchinari biosintetici della cellula per replicarsi, ha permesso che pezzi dei loro genomi rimanessero intrappolati negli ospiti e che venissero poi trasmessi di generazione in generazione. Non so se vi rendiate conto, ma l’8% di 3 miliardi di paia di basi (tant’è il nostro genoma) fa una discreta quantità di basi. Considerando poi che il DNA codificante nei mammiferi si aggira attorno al 1,5-2% c’è ben da rimanere meravigliati! Se è molto chiaro il meccanismo attraverso il quale si vengano a creare questi inserti, non è altrettanto chiaro il motivo per cui queste sequenze sono sopravvissute fino a noi, ma questo discorso si infila in una cornice più ampia che riguarda il significato biologico e funzionale di tutto il DNA non codificante, che rappresenta quindi il 98% del DNA umano, alla luce inoltre di numerosi studi che illustrano come nonostante questo DNA non contenga informazioni per sintetizzare proteine, venga comunque trascritto in RNA che costituiscono la cosiddetta materia oscura biologica (Dark Matter).
La struttura genomica di un retrovirus è abbastanza standard, nel virus il genoma è sottoforma di RNA a singolo filamento, ed è presente in doppia copia, quindi sono virus Diploidi. Una volta entrato nella cellula, grazie alla trascrittasi inversa ciascun filamento di RNA viene retrotrascritto in DNA a doppio filamento, ma il processo di retrotrascrizione, che ho descritto nel mio articolo apposito sui retrovirus, determina un’aggiunta di due sequenze terminali identiche chiamate LTR, Long Terminal Repeats. Queste sequenze terminali sono molto importanti, primo perchè determinano la successiva integrazione del genoma virale retrotrascritto (provirus) nel genoma della cellula ospite, grazie ad apposite sequenze riconosciute dall’integrasi, e secondo perchè contengono dei siti di legame per dei fattori di trascrizione cellulari, i fattori di trascrizione (di cui ho già parlato in altri articoli) sono delle proteine che, in genere sotto forma di dimeri, riconoscono sequenze apposite di DNA e favoriscono la trascrizione dei geni a valle di queste sequenze. Quindi le LTR fanno in modo che il genoma virale venga trascritto dagli stessi fattori di trascrizione e dalla stessa RNA polimerasi cellulare. Il problema è che queste LTR potrebbero in qualche modo favorire la trascrizione di geni cellulari oltre che virali, è un evento che per quanto raro non si può escludere. E’ come se si venisse a creare un modello sperimentale come quelli che solitamente i biologi costruiscono artificalmente, ovvero per fare esprimere un gene in un modello biologico (linea cellulare, animale) si associa questo gene ad un promotore cosiddetto forte, ovvero un promotore che è dimostrato funzioni bene in quel particolare modello, se voglio fare esprimere un gene in una linea cellulare epatica, di certo non andrò ad usare un promotore del gene della catena alfa dell’emoglobina perchè so già che è un gene silenziato negli epatociti e quindi non funzionerebbe, mentre protei usare un promotore di un gene che normalmente è espresso come quello della Piruvato chinasi (un enzima espresso in tutte le cellule dell’organismo in quanto indispensabile per la glicolisi). In questo caso abbiamo l’introduzione di un promotore virale, che per necessità dovrà essere un promotore forte, che potrebbe attivare la trascrizione di geni cellulari.
Normalmente tutte le sequenze retrovirali che sono fossilizzate nel nostro genoma non sono attive, anzi sono attivamente represse attraverso le metilazioni della citosina (un marcatore epigenetico che determina la totale inattività della sequenza). E’ possibile però che ci siano delle alterazioni nello stato della metilazione di alcune di queste sequenze e questo provocherebbe la riattivazione di queste LTR. Se queste LTR riattivate dovessero essere in prossimità di geni che favoriscono la proliferazione o sopravvivenza della cellula, i cosiddetti oncogeni, potremmo ritrovarci ad una possibile iniziazione tumorale, con una cellula potenzialmente senza controllo. Inoltre il concetto di prossimità a livello cromosomico è abbastanza relativo, ma proprio a proposito di questo volevo parlarvi di un articolo pubblicato sullo stesso numero dell’editroriale (per il quale l’editoriale è stato scritto), in cui dimostrano che in cellule di una determinata neoplasia, un Linfoma di Hodgkin, era attivata l’espressione in modo costitutivo di un gene, CSF1R (Colony Stimulating Factor 1 Receptor), la cui proteina è un recettore per un fattore di crescita CSF1 che normalmente è espresso a livello delle cellule staminali emopoietiche e che poi viene represso quando le cellule si differenziano nelle cellule del sangue. Infatti mentre le linee cellulari derivate dai campioni tumorali esprimevano sia il recettore che il ligando (In questo modo le cellule tumorali si autostimolano in un modo conosciuto come Loop Autocrino), le linee cellulari non tumorali no. Dimostrato il ruolo oncogenico di CSF1-CSF1R, i ricercatori hanno dimostrato (sequenziando il trascritto di CSF1R) che nel messaggero del gene era inclusa una porzione di 250bp che normalmente dovrebbe stare molto più a monte del gene stesso (6 Kilobasi), questa sequenza allineava con una sequenza retrovirale, che aveva perduto le metilazioni che la inattivavano e quindi aveva iniziato a stimolare l’espressione del gene in questione, e che evidentemente si fondeva con il trascritto per un evento di splicing alternativo.

Ovviamente ho fatto un riassunto molto stringato dell’articolo, consiglio a chi potesse di andarselo a leggere, darò le indicazioni nella bibliografia. In ogni caso credo sia chiaro che cosa significhi l’espressione the enemy within, e credo anche che bisognerebbe riflettere ulteriormente sul significato biologico di queste sequenze retrovirali fossilizzate nel nostro genoma.
Come ulteriore consiglio, suggerisco di leggere anche il mio vecchio articolo sui Virus (e retrovirus) oncogeni, che chiude il quadro della questione.

Se avete domande o qualsiasi altra cosa da dire usate i commenti! Alla prossima.

Mi sono basato su:

Lamprecht et al, “Derepression of an endogenous long terminal repeat activates the CSF1R proto-oncogene in human lymphoma”, Nature Medicine, May 2010;

Michael E Engel & Scott W Hiebert: The enemy within: dormant retroviruses awaken. Nature Medicine, May 2010;

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Retrovirus

20 novembre 2010 in lente di barlow by Manuel | 3 comments

Ho deciso di dedicare questo post ad una famiglia di virus molto importanti: i Retroviridae. Preparatevi perchè sarà un bel mattone!
Perchè così tanto interesse per dei virus? Innanzitutto perchè lo studio dei virus spesso ha aiutato a comprendere alcuni importanti meccansimi molecolari, come lo splicing, la retrotrascrizione, l’oncogenesi e molto altro. Poi perchè alcuni virus sono responsabili di importanti patologie e quindi è bene che si studino per cercare di trovare delle possibili cure. At last but not the least perchè i virus possono essere usati come vettori in biologia. Ma ogni cosa a suo tempo.
Iniziamo con una descrizione generale di un Virus. Un virus è un agente infettivo che parassita le cellule. Ogni organismo vivente, dai batteri ai protozoi, dalle piante agli animali, ha i suoi propri virus. Ci sono virus specie-specifici, ovvero che infettano soltanto una singola specie e virus che hanno una minore specificità. Una volta infettata la cellula, ne utilizzano i meccanismi e le risorse per produrre quante più copie di loro stessi è possibile. Questo è, diciamo, quello che maggiormente si sa dei virus. Sono entità che è difficile classificare come organismi viventi veri e propri, ma a conti fatti lo sono. Esistono probabilmente da quando esistono le cellule, e si sono evoluti assieme agli ospiti che infettano. Nonostante vengano associati a malattie infettive mortali, il numero di virus effettivamente patogeni e pericolosi è relativamente basso. In particolare si è osservato che i virus più pericolosi sono in genere quelli che si sono evoluti più  recentemente per cui non abbiamo ancora imparato a contrastarli efficacemente. Se prendiamo invece i virus dell’influenza, a parte i casi di pandemie come quella della spagnola, difficilmente ce ne dobbiamo preoccupare, perchè coesistono con noi da centinaia di migliaia se non milioni di anni.
Solitamente sono delle particelle, di poche decine di nanometri di diametro, costituite da un involucro proteico (Capside) al cui interno è contenuto il genoma (DNA o RNA, a singola o a doppia elica). Il capside può essere a sua volta rivestito da un envelope, una membrana fosfolipidica di origine cellulare, all’interno della quale sono inserite delle glicoproteine virali.
La struttura del capside è dovuta al tipo di interazioni che le proteine che lo costituiscono hanno tra di loro. E’ stato osservato che o si presentano con struttura elicoidale oppure icosaedrica o mista.
Una volta terminato il ciclo vitale, le particelle virali (virioni) devono uscire dalla cellula ospite, e nel far questo o la lisano provocandone la morte, oppure semplicemente gemmano portandosi dietro frammenti di membrana plasmatica contenenti delle proteine virali. Queste proteine sono fondamentali al virus perchè sono il mezzo con cui il virus riconosce le cellule e le infetta, o attraverso “l’iniezione” del contenuto del capside all’interno del citoplasma o attraverso l’assorbimento dell’intero virione.
Retroviridae. A questa famiglia appartengono, appunto, tutti i retrovirus. Cos’hanno di particolare i retrovirus? Non tanto che hanno il genoma di RNA, quanto al fatto che questo genoma è presente all’interno della particella virale in doppia copia, si tratta quindi di un genoma diploide. Inoltre, questo genoma nonostante sia RNA non viene tradotto direttamente in proteine (come succede per altri virus a RNA), ma viene retro-trascritto in DNA a doppio filamento da una proteina interessantissima, la Trascrittasi Inversa o Retrotrascrittasi (RT), il DNA viene trasportato nel nucleo della cellula (Alcuni retrovirus non sono in grado di attraversare la membrana nucleare, quindi aspettano che la cellula si divida e che la membrana nucleare si dissolva) e viene integrato nel DNA dell’ospite, in posizioni casuali, ad opera di un enzima virale, l’integrasi che, assieme alla RT, è già presente assieme all’RNA genomico nel capside. Il DNA virale integrato (provirus) viene trascritto dalla RNApolimerasi della cellula ospite e vengono prodotti: RNA messaggeri che verranno maturati e tradotti in proteine, e RNA dell’intera lunghezza del genoma virale che costituirà poi il materiale genetico che verrà poi incluso nella particella virale in costruzione.
E’ un ciclo replicativo estremamente interessante ed estremamente complesso da studiare nel dettaglio (quindi lo risparmio, a meno che qualcuno non volesse approfondire l’argomento). Mi limiterò a parlare dei retrovirus in generale.
I retrovirus sono stati importantissimi per diversi motivi: il primo è che sono stati coloro che hanno abbattuto il dogma centrale della biologia molecolare, che prevedeva che l’informazione passasse invariabilmente da DNA a RNA e mai viceversa; hanno permesso la caratterizzazione di questo enzima fenomenale, che è la trascrittasi inversa, utilissima in laboratorio; grazie a loro sono stati scoperti i cosiddetti oncogeni (di cui ho parlato a bizzeffe, ma  che non mi stancherò mai di spiegare!!). Un dato interessante è che circa l’1% del nostro genoma è di origine retrovirale, e non è poco! Questo dimostra che i retrovirus ci accompagnano da molto, molto tempo.
Parliamo della trascrittasi inversa. Questo enzima è stato scoperto negli anni settanta da Baltimore e e Temin. E’ una proteina con diverse funzioni. E’ una DNA polimerasi RNA dipendente, una DNA polimerasi DNA dipendente e una ribonucleasi H (ovverossia digerisce l’RNA quando è accoppiato con DNA). Tanta roba, insomma. La RT inizia la sintesi di DNA usando come stampo l’RNA virale ed usando come primer (come innesco) un RNA transfer proveniente dalla cellula ospite che si lega all’RNA virale vicino alla sua estremità 5′ (Gli acidi nucleici hanno un’estremità 5′, cinque primo, ed un’estremità 3′, tre primo, e vengono sempre sintetizzati in direzione 5′-3′ a  partire da un primer, ovvero una sequenza di DNA o RNA che serve da innesco). Partendo da questo primer, la RT sintetizza il DNA, fino all’estremità 5′ dell’RNA virale, e qui si ferma perchè non c’è più nessuno stampo. Come ho detto prima, la RT ha anche una funzione di ribonucleasi H (ovverossia digerisce l’RNA quando è accoppiato con DNA), e questa è proprio la situazione a cui siamo di fronte, abbiamo del DNA appena sintetizzato ibridizzato con l’RNA virale. L’RNA viene degradato (non tutto, ma solo la zona ibridizzata col DNA) lasciando un filamento sporgente di DNA che si andrà ad accoppiare con l’estremità 3′ o della stessa identica molecola di RNA, oppure della sua compagna (i retrovirus hanno due copie di RNA identiche). Questo permette alla RT di continuare la sinetsi di DNA usando come primer il DNA sintetizzato all’inizio. Sintetizzato il primo filamento di DNA, l’RNA viene giustamente degradato, e deve essere sintetizzato il filamento complementare. In questo caso, i primer utilizzati sono dei primer di RNA che non sono stati completamente degradati dalla RT e che permettono il completamento del secondo filamento di DNA. Affascinante quanto complesso. Il DNA appena sintetizzato viene poi integrato nel DNA della cellula ospite.
Durante tutto questo tempo, la RT è diventata patrimonio di moltissimi laboratori di biologia molecolare e non solo. Viene utilizzata, ad esempio, per trasformare gli RNA messaggeri cellulari in DNA (cDNA) e poi su questi cDNA si possono eseguire delle PCR per quantificarli, clonarli, sequenziarli.. in questo modo si sono compresi molti processi regolativi. Attualmente ci sono dei sequenziatori automatici che sono in grado di sequenziare tutti gli RNA messaggeri cellulari presenti in un dato momento dopo averli retrotrascritti in cDNA. In questo modo si studia l’espressione genica cellulare nel tempo. Insomma, una serie di applicazioni estremamente affascinanti.
La RT inoltre non è a prova di errore, anzi! Si stima che in vivo il suo tasso di mutazione sia una ogni centomila nucleotidi. Che non è poco! Questa è la causa principale dell’evoluzione continua di questi virus.
I retrovirus sono stati anche il mezzo attraverso il quale sono stati scoperti gli oncogeni. Si stima che una buona fetta di tumori siano associabili a delle pregresse infezioni virali. Virus come quello del papilloma, quello dell’epatite B e C, il virus di Epstein-Barr (nessuno di questi è un retrovirus) sono associati rispettivamente al tumore del collo dell’utero, epatocarcinomi e Linfoma di Burkitt. Ci sono diversi modi con cui un virus può generare tumori.  Ad esempio, il virus del papilloma è cancerogeno perchè durante il suo ciclo virale produce due proteine (E6 ed E7) che inibiscono le proteine cellulari Rb e p53 (di cui ho parlato nel post: P53, il guardiano del genoma) sono due potenti oncosoppressori. Come sappiamo, se un oncosoppressore viene inibito si facilita lo sviluppo del cancro. Il virus di Epstein-Barr invece integra il suo genoma all’interno dei linfociti B dell’ospite. Se la cellula non viene lisata e se il genoma virale si è integrato in zone critiche (per esempio all’interno di un oncosoppressore, rendendolo inattivo, oppure nei pressi di un oncogene alterandone l’espressione) allora quel linfocita B può trasformarsi e diventare una cellula tumorale (anche perchè EBV produce alcune proteine, come LMP in grado di immortalizzare le cellule). Altrimenti, alcuni Virus (retrovirus) (per fortuna non ne sono ancora stati documentati sull’uomo) che vengono detti virus trasformanti acuti, portano nel loro genoma un gene estraneo, di origine cellulare, che è stato inglobato per sbaglio chissà quando durante l’evoluzione. Se questo gene è un oncogene abbiamo un’alta possibilità che la cellula infettata si trasformi. E’ questo il caso del cosiddetto Virus del sarcoma di Rous, scoperto all’inizio del ’900 da un medico americano, Rous appunto, che studiava il modo in cui un tumore del pollo si estendeva tra esemplare ad esemplare in maniera “infettiva”. Soltanto negli anni settanta si scoprì che questo virus era un retrovirus e che era così oncogeno perchè portava nel suo genoma una sequenza estranea che codificava per una proteina che è stata chiamata SRC (si pronuncia sarc, da sarcoma di Rous, appunto). SRC, che è stato il primo oncogene ad essere così scoperto,  non è una sequenza virale ma è derivata da un gene presente in moltissimi organismi, uomo compreso, ed è fondamentale nella sopravvivenza della cellula.  Come ho detto, questa sequenza deve essere stata inglobata per errore e nel tempo la forma virale (v-src) ha accumulato mutazioni su mutazioni (non sono sottoposte a selezione naturale) e che hanno reso costantemente attivata la proteina, funzionando quindi come oncogene attivato.  Con SRC si è aperto tutto un mondo all’oncologia molecolare, e se ne sono trovati tanti altri.

Ma adesso cambiamo leggermente discorso, e parliamo del più famoso dei retrovirus: HIV. Di HIV si può dire tutto, tranne che sia oncogeno. I pazienti infetti da HIV e con AIDS conclamata possono sviluppare dei tumori, ma questi non sono dovuti ad HIV quanto ad un altro virus, HHV-8, altrimenti noto come virus del sarcoma di Kaposi. Non starò qui a spiegare la patogenesi di HIV nè il modo con cui si contrae.  Se volete avere informazioni sull’epidemiologia di HIV e sulla sua diffusione vi consiglio il sito di UNAIDS. Mi limiterò a parlare di un argomento meno noto, ma molto interessante, che è l’origine di questo virus. HIV è un retrovirus, appartenente alla sottofamiglia dei Lentivirus. Da quando è scoppiata la pandemia, circa all’inizio degli anni ’80 del secolo scorso, si è cercato di capire da chi, quando e dove fosse spuntato questo virus, che prima praticamente non esisteva! I primi virus che si ipotizzò potessero essere i progenitori di HIV furono i lentivirus dei primati. In particolare, un virus subito saltò all’occhio, il SIV, o Simian Immunodeficiency Virus, che infetta una grande varietà di primati africani. Ci sono diversi SIV in circolazione. in partcolare il SIV degli scimpanzè sembra aver dato origine al HIV-1, mentre il SIV di una scimmia, il Cercocebus atys ha dato origine ad HIV-2. Perchè di HIV ce ne sono due ceppi, decisamente diversi tra di loro,  perchè derivano da due SIV diversi. l’HIV-1 è quello più diffuso e più virulento dei due. Tutte quste informazioni si sono ottenute studiando i virus dal punto di vista molecolare.
Rimane da chiarire quando e come è avvenuta la trasmissione tra scimmia a uomo. In alcune parti dell’Africa centrale è d’uso cacciare e nutrirsi di scimmie. Questa pratica può aver reso possibile l’infezione e quindi la trasmissione di quei virus che non solo erano in grado di infettare l’uomo, ma anche di passare da uomo a uomo. Non so in base a quali criteri, inoltre, sembra il primo passaggio del virus HIV dalla scimmia all’uomo sia avvenuto attorno agli anni 30 del secolo scorso, e poi portato in tutto il mondo. Teniamo anche presente che quelle zone (come del resto tutta l’africa, erano zone coloniali, è facile quindi pensare una trasmissione scimmia-> autoctoni-> colonialisti. La pandemia ha avuto un periodo di latenza abbastanza ampio, circa quarant’anni, prima di esplodere.
Un’ultima considerazione. Il tasso di mutazione di HIV è molto elevato. Quello che sorprende è che all’interno di un’unica persona infetta si sviluppano ceppi differenti di questo virus, e man mano si selezionano i più virulenti. Questo è dovuto alla bassa fedeltà con cui la RT trascrive il genoma virale.

Ok, so di avere scritto fin troppo. Spero di non avervi annoiato. Se avete domande o correzioni da fare usate i commenti!

References:

On the origin and evolution of the human immunodeficiency virus (HIV), EDWARD C. HOLMES. Biol. Rev. (2001), 76, pp. 239–254

Retroviral reverse transcriptases, Alon Herschhorn • Amnon Hizi. Cell. Mol. Life Sci. (2010) 67:2717–2747

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