Pol

Ammetto che i retrovirus turbano la mia mente, come biologo molecolare mi sento profondamente attratto da loro (patogeni esclusi), basta vedere quanta attenzione ho loro dedicato! Sarà che ben l’8% del mio genoma in realtà è retrovirale? Ma se è per questo anche il vostro (vedere articolo precedente)!
Un vettore molecolare è un sistema per trasferire elementi genici (geni interi, frammenti di geni, elementi regolatori) in un sistema accettore compatibile. Gli esempi di vettori più semplici che abbiamo sono i plasmidi batterici, molecole di DNA circolare (che si trovano normalmente in natura come elementi extracromosomici nei batteri, appunto) all’interno delle quali possiamo inserire dei geni di nostro interesse, dopodichè non dobbiamo “far altro” che introdurre questi plasmidi “pieni” all’interno dei batteri scelti (processo detto trasformazione) e in questo modo i batteri, che faremo proliferare, produrranno numerose copie di questo plasmide e se è il caso esprimeranno anche la proteina relativa (per approfondire leggere il mio vecchio articolo cloning a gene)!
I vettori retrovirali hanno la stessa filosofia di base, ma sono decisamente più sofisticati e raffinati. Ma andiamo con ordine! Ovviamente un vettore retrovirale si basa sulla biologia dei Retrovirus di cui, come ho già detto nell’articolo precedente, ho già parlato anche fin troppo (Qui e Qui e Qui), per cui non sto a rispiegare cosa sono e cosa fanno.

Quello che spiegherò invece è la struttura del genoma retrovirale; un retrovirus ha un genoma a RNA a singolo filamento. Alle estremità di questo filamento ci sono due sequenze terminali diverse, una sequenza terminale 5′ costituita da una regione chiamata R e una regione chiamata U5, e una sequenza terminale 3′, costituita da una sequenza chiamata U3 e una copia identica della sequenza R.

R-U5_________________(RNA a singolo filamento)_______________U3-R

Queste sequenze (R-U5 e U3-R) sono estremamente importanti sia nell’integrazione del genoma virale (retrotrascritto poi in DNA), sia nell’espressione dei geni virali da parte di fattori di trascrizione dell’ospite. Durante la retrotrascrizione, il processo col quale il Genoma virale di RNA a singolo filamento viene trasformato in un genoma a DNA a doppio filamento (leggere il post Retrovirus), vengono aggiunte dei pezzettini al genoma in costruzione, e queste sequenze sono rispettivamente la sequenza U3 al 5′ (prima della sequenza R) e di U5 al 3′, (dopo la sequenza R). In questo modo, quelle che nel genoma a RNA erano sequenze terminali diverse (R+U5 vs U3+R), ora sono diventate delle sequenze terminali identiche (U3-R-U5 e U3-R-U5) Queste sequenze sono chiamate LTR, Long terminal Repeats.

U3-R-U5_____________(DNA a doppio Filamento)______________U3-R-U5

All’interno del genoma, tra queste due LTR ci sono ovviamente i geni retrovirali. I tre geni più importanti sono chiamati Gag, env e pol, che codificano ciascuno per diverse proteine. Il gene gag codifica per le proteine del capside virale, Env codifica per le proteine dell’envelope e Pol codifca per proteine come la retrotrascrittasi, l’integrasi e la proteasi.
La trascrizione di questi geni inizia una volta che il Genoma a DNA si è integrato. I trascritti possono Monocistronici (ovvero contenere un solo gene) oppure policistronici. La maturazione delle proteine virali avviene poi attraverso la proteasi che dai precursori genera le proteine definitive.
Oltre a Gag, Pol e env, ci sono anche altri geni accessori che possono variare da retrovirus a retrovirus, e hanno il compito di facilitare l’operato del virus, molto famosa è, nell’HIV, la proteina Tat, codificata dal gene omonimo, che è un trans-attivatore, ovvero è una proteina che durante la trascrizione del genoma del virus integrato, si lega al trascritto nascente e permette di aumentare l’efficienza della trascrizione stessa consentendo la produzione di trascritti full-lenght, senza questa proteina il virus sarebbe in grado di sintetizzare solo messaggeri troppo corti.

Un vettore retrovirale sfrutta la capactà dei retrovirus di INFETTARE le cellule e di INTEGRARE il loro genoma in quello delle cellule ospiti. In questo modo possiamo trasferire e far esprimere geni che vogliamo ai nostri modelli sperimentali (linee cellulari, animali) in maniera permanente e stabile. Quello che ci serve prima di tutto è quindi il genoma di un retrovirus, all’interno di questo genoma che è solitamente lungo una decina di kilobasi, dobbiamo inserire il gene di interesse. I problemi sono 2, il primo è che la somma tra il genoma retrovirale e il gene di interesse non deve superare una soglia critica, perchè altrimenti il vettore non potrà essere inserito all’interno del virus (capside) stesso per motivi di spazio. Il secondo è che non possiamo lavorare con il genoma ad RNA. Per il primo problema si è fatto sì che si sviluppassero dei vettori retrovirali estremamente ridotti, ovvero contenenti soltanto le LTR terminali ed una sequenza molto importante chiamata di incapsidamento (spiegherò dopo il significato). In questo modo, avendo eliminato tutti i geni retrovirali, io posso inserire all’interno delle LTR il mio gene di interesse. Il secondo problema è stato aggirato lavorando su vettore retrovirale in DNA. Tra tutti i vettori retrovirali, i più diffusi sono quelli lentivirali (i lentivirus sono una sottoclasse dei retrovirus)

In questo Vettore retrovirale abbiamo le due sequenze LTR, e una sequenza Psi che è la sequenza di incapsidamento. Dopodichè abbiamo due geni, uno che codifica una proteina che conferisce resistenza all’ampicillina esterno alle LTR, e un altro che codifica una proteina che conferisce resistenza ad un altro antibiotico, la neomicina che è interno alle LTR e sotto un promotore specifico SV-40 (SV-40 è un promotore appartenente ad un virus delle scimmie, ma non un retrovirus). Che cosa servono questi due geni di resistenza antibiotica? Servono per selezionare. Per iniziare, devo trovare il sistema per inserire il gene di interesse nel vettore di cui vedete sopra un’immagine (esistono tantissimi tipi di vettori retrovirali, e lentivirali in particolar modo). Il modo tradizionale consiste nell’usare degli enzimi di restrizione. Un enzima di restrizione è un enzima che taglia un doppio filamento di DNA, riconoscendo una specifica sequenza. Se io taglio il mio vettore, con un enzima che riconosca una sequenza una sola volta, e che quindi faccia un solo taglio (Per fare questo c’è una mappa di restrizione che indica i diversi siti di taglio presenti sul vettore), e in particolar modo riconosca una sequenza presente nella regione chiamata MCS, io aprirò il mio vettore, lo renderò una molecola di DNA lineare. Il taglio deve generare preferibilmente delle sticky ends, in modo che, usando lo stesso enzima per il mio gene di interesse (facendo attenzione che non lo tagli in mezzo, ma solo alle estremità), Io potrò incastrare il mio gene di interesse all’interno del mio vettore linearizzato proprio perchè avranno le estremità complementari. Legando il mio gene al mio vettore, questo si ricircolarizzerà, generando una molecola di DNA circolare con dentro il mio gene. Il gene è inoltre stato inserito in mezzo alle due LTR retrovirali (perchè ho utilizzato un enzima che tagliasse nel MCS). Ci sono inoltre dei metodi per inserire il gene nella direzione giusta, in modo che sia sotto il controllo del giusto promotore retrovirale (clonaggio direzionale).
Dopodichè si utilizzano dei batteri, all’interno dei quali inseriamo il nostro vettore per aumentarne la quantità. Solo i batteri che hanno assunto il vettore saranno in grado di crescere in un terreno contenente ampicillina, in questo modo io seleziono esclusivamente i batteri che mi servono, quelli che hanno il vettore. La domanda che potreste fare è: ma se visto che ho due geni che danno la resistenza due antibiotici diversi, uno chiaramente per i batteri e l’altro per le cellule eucarioti, sono interscambiabili? Posso cioè utilizzare la neomicina per selezionare i batteri anzichè l’ampicillina? la risposta è no, perchè in questo caso il gene della resistenza alla neomicina è sotto un promotore specifico per le cellule eucarioti, e i batteri non lo leggerebbero, per cui i batteri non sono resistenti alla neomicina, mentre le cellule eucarioti non sono sensibili all’antibiotico ampicillina per cui la selezione invertita non funzionerebbe.
Una volta ottenute grandi quantità di vettore, devo passare allo step successivo. Ovvero creare il retrovirus che contenga come genoma il mio vettore che ho appena costruito. Per fare questo devo tenere conto di diverse cose. innanzitutto, il mio vettore retrovirale, che ho appena costruito da solo non è in grado di produrre nessun virus visto che gli mancano tutti i geni (che gli sono stati tolti per far spazio al gene di mio interesse). Pertanto devo utilizzare un sistema di vicariaggio, ovvero inserire artificilamente il mio vettore appena fatto in cellule apposta (trasfezione). Queste cellule sono chiamate cellule Helper, poichè portano al loro interno tutti i geni retrovirali necessari (gag, env, pol ecc) ma senza la sequenza di incapsidamento. Quindi le cellule helper sono in grado di fornire al mio vettore le proteine neccessarie a integrarsi e trascriversi, sono in grado fabbricare le proteine strutturali virali e quindi di fabbricare il corpo del virus all’interno del quale dovrà incapsidarsi il nostro vettore di interesse. A questo punto entra in gioco il secondo fattore, ovvero la sequenza di incapsidamento: mentre il vettore che contiene il gene di mio interesse contiene la sequenza di incapsidamento, quello che fornisce le proteine retrovirali no, pertanto è impossibile che si vengano a creare dei virus contenenti il vettore con gag env e pol, ma solo quello contenente il gene che voglio. Le cellule Helper sono ottenute infettando delle cellule con un retrovirus privato della sequenza psi; con i primi protocolli accadeva che durante il processo di produzione dei retrovirus, si generassero spontaneamente dei retrovirus replicazione competenti (al contrario di quelli che si volevano ottenere, dei virus replicazione-incompetenti); questa reversione spontanea era dovuta ad eventi di ricombinazione tra il vettore col gene di mio interesse e il vettore con i geni virali standard privato della sequenza psi. Per ovviare a questo problema, si iniziò a transfettare le cellule Helper con vettori separati: uno che codifica per i geni gag-pol, ed un secondo vettore che contiene invece il gene env. Il gene env è molto importante perchè codifica per le proteine di superficie, quelle dell’envelope, che sono le proteine con cui il virus riconosce le cellule e le infetta. Il gene env quindi detrmina la specificità (tropismo) del virus nei confronti dell’ospite. Oltre a questo accorgimento si iniziarono a togliere tutte le sequenze non indispensabili dai vettori helper, per ridurre la probabilità di ricombinazione.
Quindi alla fine della fiera, io inserisco il mio vettore retrovirale nelle cellule helper, e queste cellule helper dopo alcuni giorni di incubazione mi daranno numerose particelle virali contenenti il vettore di mio interesse, anche se sulla totatilità solo una percentuale sarà effettivamente attiva (alcune particelle potranno infatti essere vuote). Io quindi prelevo dal terreno di coltura di queste celluel helper i miei virus, e posso usarlo per infettare le mie cellule. Il virus che ho ottenuto, sarà quindi come stabilito, replicazione incompetente perchè il suo genoma non è in grado di produrre le proteine virali, questo fa sì che quando utilizzerò il virus appena prodotto per infettare le cellule designate, che non sono più cellule helper, ma cellule normali, si avrà soltanto il processo di infezione, di retrotrascrizione e di integrazione del genoma virale e non si avrà nessuna produzione di virus. Ovviamente le cellule da infettare devono essere compatibili con il virus ottenuto, e la compatibilità è data, come ho detto prima, dalle proteine dell’envelope.
Quindi, lo step finale è quello di utilizzare i virus prodotti per infettare le cellule, normalmente quello che si fa è di creare sia un controllo positivo che un controllo negativo. Il controllo positivo può essere un retrovirus contenete nel suo genoma il gene della GFP, in modo che questo renda facile la quantificazione dell’efficienza di infezione (in base al numero di cellule con la fluorescenza verde). Il controllo negativo è un vettore retrovirale vuoto, senza nessun gene inserito, questo serve a controllare gli effetti dell’integrazione casuale che il genoma retrovirale subisce. Inoltre, le cellule infettate col virus vengono fatte crescere in un terreno contenente neomicina (nel caso del vettore in figura), per selezionare solo le cellule che hanno integrato il vettore. Le cellule infettate quindi esprimeranno stabilmente il gene di mio interesse, e il vantaggio di usare vettori retrovirali è che l’efficienza di infezione è molto alta, molto più alta di qualsiasi altro metodo “gene-delivering”.

Ora, per finire, vorrei parlarvi delle apllicazioni pratiche di questo sistema. A cosa mi serve creare dei retrovirus per far esprimere geni di mio interesse? Beh, senz’altro a studiare gli effetti dell’espressione di uno o più geni in un sistema controllato. Ad esempio io trovo che in un particolare tipo di tumore ricorre una particolare mutazione in un gene specifico. Per dimostrare che questa mutazione sia o meno importante nella generazione del tumore, io posso utilizzare dei vettori retrovirali per infettare cellule che non esprimono quel gene con la forma mutata e con la forma standard e osservare le differenze di comportamento nelle cellule infettate.
Un altro campo di applicazione è la cosiddetta Gene-therapy, terapia genica, ovvero il tentativo di curare malattie attraverso l’espressione di geni estranei. Famoso è il caso del deficit di adenosina deaminasi (ADA-deficiency), una malattia genetica che causa una gravissima immunodeficienza congenita. Si è provato a prelevare le cellule staminali emopoietiche di bambini malati, e infettarle con un retrovirus contenente il gene dell’enzima ADA. Straordinariamente le cellule transgeniche, una volta reimmesse nel midollo osseo dei bambini, davano origine a cellule immunitarie funzionanti, eliminando così l’immunodeficienza. Questi sono rari casi di successo nei protocolli di terapia genica attualmente in corso. bisogna sottolineare come, essendo l’integrazione del virus casuale, questo possa rappresentare un rischio di mutagenesi-virus-indotta. Altre applicazioni consistono nell’utilizzare dei vettori retrovirali per far esprimere geni come l’insulina nei diabetici (in corso di sperimentazione), o di utilizzare questi vettori come “bombe” mirate a far suicidare le cellule tumorali (introducendo geni antiproliferativi come p53), il problema è quello di riuscire a costruire dei vettori specifici soltanto per le cellule tumorali.
Concludo con una nota sulla sicurezza in laboratorio durante la produzione di questi virus. Il pericolo maggiore per i ricercatori è quello ovviamente di infettarsi con il virus prodotto, questo ovviamente è tanto più possibile quanto più compatibile è il virus con l’essere umano. Per questo è obbligatorio seguire rigide preocedure di sicurezza (lavorare in laboratori attrezzati specificamente e adibiti apposta, lavorare sempre sotto cappa, indossare mascherina e indumenti protettivi ecc, buon senso)

Spero di non avervi annoiato! Se avete domande, usate i commenti!