Bottiglie di Leida » DNA

Professione proofreader

Manuel — Sun, 27 Mar 2011 21:50:47 +0000

Dicesi proofeader un correttore di bozze. Una persona cioè che rilegge i testi da pubblicare per individuare gli errori e correggerli. Gli errori si sa è impossibile eliminarli completamente, ma un buon correttore di bozze ne individua ed elimina la maggiorparte, rendendo i rimanenti trascurabili e il testo leggibile.
Ciò a cui voglio arrivare con questa introduzione probabilmente l’avrete già capito. Sono un tipo prevedibile, non c’è dubbio! Ciò che noi chiamiamo correttore di bozze è una perfetta analogia con la correzione degli errori a livello del DNA. Abbiamo in entrambi i casi una montagna di informazioni che deve essere preservata affinchè sia funzionale. Durante ogni processo di Replicazione del DNA (che precede ogni divisione cellulare), ma anche durante la normale vita cellulare il DNA, i nostri geni, possono subire delle alterazioni. Nel primo caso infatti, gli enzimi che sintetizzano il nuovo filamento di DNA a partire da quello vecchio, con una frequenza variabile, possono copiare in modo errato il DNA, introducendo così una mutazione. Accoppiare una A con una G, induce una mutazione. Nel secondo caso, invece, eventi esterni come l’esposizione ad agenti cancerogeni (che sono mutàgeni, ovvero inducono mutazioni) oppure interni come la liberazione di Radicali liberi, possono danneggiare o mutare il DNA. Se questi errori non fossero individuati e corretti si svilupperebbe una instabilità genomica tale che la vita degli organismi sarebbe messa seriamente a rischio. Ovviamente durante l’evoluzione si sono selezionati numerosi geni che entrano a far parte dei cosiddetti: “Sistemi di riparazione del DNA”. Questi sistemi sono costituiti da enzimi in grado di riconoscere le anomalie e nella maggiorparte dei casi di correggerle. Esistono delle patologie ereditarie in cui alcuni geni che codificano per questi enzimi sono mutati e non funzionanti. I sfortunati soggetti affetti da queste malattie hanno un genoma più instabile rispetto alle persone normali, e più soggetto a mutazioni. Tutto ciò si traduce in un marcato aumento del rischio di sviluppare tumori in giovane età (Xeroderma Pigmentoso).
Addentriamoci maggiormente nell’argomento. In maniera molto schematica, possiamo dividere i sistemi di riparazione del DNA in base al meccanismo con cui l’acido nucleico viene riparato.
Immaginamo di avere una lesione al DNA molto seria, e per lesione al DNA intendo, ad esempio, nucleotidi ai quali sono legati covalentemente dei gruppi chimici. E’ questo il caso, ad esempio, dell’esposizione ad alcuni agenti cancerogeni detti (Agenti Alchilanti, che trasferiscono sui nucletodi gruppi alchilici, modificandoli. In questo caso la via preferenziale è l’escissione dei nucleotidi alterati, attraverso il taglio del filamento danneggiato ai lati della lesione, l’eliminazione del frammento escisso e la sintesi grazie all’intervento della DNA polimerasi della regione mancante usando come stampo il filamento non danneggiato. Questo meccansimo viene definito Nucleotide Excision Repair, per gli amici NER. Si ritiene che il NER sia utilizzato nei casi in cui, durante la trascrizione di un gene, la RNA polimerasi si blocchi a causa dell’errore. In questo caso l’errore viene riconosciuto e corretto dando la precedenza ai geni che vengono trascritti rispetto a quelli che sono silenziati.
Parliamo invece di BER, ovvero Base Excision Repair, quando non si tratta di eliminare l’intero nucleotide, o sequenza di nucleotidi, come nel NER, ma soltanto la base azotata. Infatti, molte volte ad essere alterata nel DNA è proprio la base azotata (A, T, G, C). Ad esempio, spontaneamente la Citosina può convertirsi in Uracile, attraverso la perdita di un gruppo amminico. L’uracile non è una base consentita nel DNA, pertanto in questo caso il BER interviene, elimina l’uracile e, dato il fatto che l’uracile si trovava accoppiato con una guanina viene rimpiazzato con l’appropriata citosina. Deve essere questo il motivo per cui l’uracile è stato sotituito dalla Timina nel DNA, perchè c’era il pericolo della conversione spontanea della citosina. Tuttavia, bisogna sottolineare che spesso nel DNA la citosina si trova metilata sul carbonio 5, in 5 metilcitosina per ragioni epigenetiche. Queste metilazioni sono indispendabili per la regolazione della trascrizione. La deaminazione della 5 metilcitosina dà la timina, che essendo una base naturale del DNA causa possibile confusione nei sistemi di riparazione. Un’altra modificazione spontanea delle basi azotate è quella che dall’Adenina porta all’Ipoxantina, sempre attraverso la deaminazione. L’ipoxantina non è una base comune (è un intermedio metabolico) e pertanto viene riconosciuta come errata.
Altre alterazioni possono colpire le basi azotate, e venire corrette mediante il BER.
Quello che vorrei fosse chiaro però, è che non c’è una distinzione netta tra mutazioni riparabili dal NER e quelle riparabili dal BER. C’è una certa sovrapposizione che crea ridondanza. Questo ovviamente è un meccansimo di sicurezza in più, nel caso fosse danneggiato un sistema.
Poi abbiamo il cosiddetto Mismatch Repair (MMR). Ovvero riparazione degli accoppiamenti sbagliati. La DNA polimerasi, come dicevo, non è un enzima perfetto e talvolta durante il processo di duplicazione del DNA può accoppiare due nucleotidi sbagliati. Così come negli altri casi, questa alterazione viene avvertita dai sistemi di riparazione, e viene così eliminato il nucleotide errato. Benissimo. Come distinguiamo il nucleotide errato da quello corretto? Se ci troviamo di fronte una A con una G, come fa l’enzima a sapere se è la G che è stata accoppiata alla A o viceversa? A questo proposito viene in soccorso il fatto che normalmente il filamento di DNA “originale”, quello più vecchio insomma, è distinguibile da quello nuovo grazie a delle metilazioni a livello delle Adenine in particolari sequenze come GATC. Questa sequenza ha una frequenza di circa 1/256, e l’enzima che opera questa metilazione è chiamato Dam metilasi. Il filamento appena sintetizzato ci impiega un po’ di tempo prima di essere metilato, per cui c’è un intervallo di tempo nel quale i sistemi di riparazione possono distinguerlo. A volte le cose più semplici sono quelle più vincenti.
Abbiamo visto come il DNA sia una molecola soggetta a mutazioni. Queste mutazioni possono essere spontanee (come la deaminazione della citosina in uracile), indotte (come l’alchilazione delle basi azotate), oppure dovute alla replicazione. Abbiamo anche visto come numerosi enzimi riconoscano queste alterazioni e le riparino. Si stima che durante una divisione cellulare la frequenza di mutazione si aggiri attorno a 1.4E-10 per nucleotide/cellula/divisione, che è un valore virtualmente nullo.
Immaginiamo però una situazione più grave. Immaginiamo un caso in cui entrambi i filamenti della doppia elica sono danneggiati. Magari perchè sono rotti (DSB, double strand breaking). Casi simili possono essere dovuti all’esposizione di radiazioni elettromagnetiche come raggi UV o peggio, raggi gamma. In questo caso non abbiamo un filamento a cui affidarci per la riparazione. In questo caso abbiamo due vie. La prima, poco accurata e più semplice, si chiama Non Homologous End Joinnig (NHEJ), e consiste nel riunire i due filamenti rotti. Questo sistema non è molto accurato, e nel processo possono perdersi diversi nucleotidi, causando comunque mutazioni. Il secondo caso, invece, abbiamo la ricombinazione genetica. Ho già parlato diverse volte della ricombinazione. E’ un processo che avviene nei gameti, e si chiama crossing over, ma anche nelle cellule immunitarie e si chiama ricombinazione somatica. È un processo che prevede lo scambio di due o più segmenti genici. Può avvenire all’interno dello stesso cromosoma o avvenire tra due cromosomi diversi. In questo caso, in breve, si cerca di riparare al danno andando a “copiare” la stessa regione danneggiata sul rispettivo cromosoma omologo, che si spera non sia stato danneggiato anch’esso. Questo è uno dei vantaggi di essere diploidi, avere il Genoma in doppia copia!
Nel caso in cui il danno al DNA fosse irreparabile, molto probabilmente la cellula andrà incontro ad apoptosi, ovvero morte cellulare programmata. Questa è l’ultima difesa che abbiamo contro lo sviluppo di cellule mutate potenzialmente tumorali.

Spero che l’argomento sia stato interessante. Se avete domande, o notate errori usate i commenti!

Alla prossima!

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Fattori di trascrizione e Promotori, un sistema chiave/serratura

Manuel — Sun, 24 Oct 2010 16:32:51 +0000

Era decisamente ora che scrivessi qualcosa. Ammetto che scegliere l’argomento è stato quantomeno complicato. Da una parte c’era la famosa sperimentazione made in Italy di un vaccino contro l’HIV, dall’altra avevo in serbo alcuni argomenti di Biologia molecolare. Ovviamente ho scelto la Biologia Molecolare! E’ un argomento abbastanza vago e vasto, lo ammetto, però interessante.
I famosi Promotori. Famosi forse per chi li studia, ma un po’ meno noti per chi invece non è di questo campo. I promotori sono delle sequenze di DNA non codificante che però hanno una funzione precisa: regolare la trascrizione dei geni che controllano. Di solito i promotori sono sequenze immediatamente a monte del TSS (transcription Start Site o Sito di Inizio della Trascrizione) del gene, mentre tutte le sequenze promotrici situate più distalmente (anche migliaia di basi) dal TSS sono chiamate enhancer.
Regolano la trascrizione e quindi l’espressione genica della cellula. In che modo dunque? Abbiamo detto che sono delle sequenze. Queste sequenze sono riconosciute e legate da particolari proteine chiamate fattori di trascrizione. In maniera un po’ semplicistica possiamo dire che questi fattori di trascrizione stabilizzano il legame della RNA polimerasi, che è l’enzima, o meglio il complesso enzimatico, che è responsabile della sintesi dell’RNA messaggero usando come stampo uno dei due filamenti del DNA.
I promotori sono sempre stati eccessivamente semplificati. Per numerose decadi si pensava fossero delle sequenze precise e ben conservate alle quali si davano nomi diversi, ad esempio la TATA box era una di queste sequenze (ricca in T ed in A) situata circa 30 paia di basi dal TSS. Questi tipi di promotori sono quelli che ora vengono chiamati Textbook Promoters, promotori da libro di testo, perchè sono il modello di promotore che ancora adesso, nei corsi di primo livello, vengono insegnati. Non è che non esistano. Esistono eccome, però sono soltanto una piccola parte di questo immenso mare di sequenze. Come al solito la situazione è sempre più complessa di quanto la si possa spiegare.
L’isolamento e l’identificazione dei promotori è tuttora una grande sfida. Quasi un anno fa è uscito un articolo, su Genome Research, che pubblicava i risultati di una lunga ricerca proprio in questo campo: “Direct isolation and identification of promoters in the human genome”. Qual’è stato il loro metodo? In pratica sono andati a cercare tutte quelle sequenze genomiche in cui era presente il complesso della RNApolimerasi ancora inattiva (che doveva cioè ancora iniziare la trascrizione) usando un anticorpo diretto contro l’RNApolimerasi. L’anticorpo si lega alla RNApol che a sua volta è legata alla sua sequenza di DNA la quale viene poi identificata ed annotata. Questo metodo viene chiamata ChIP ovvero Chromatine immuno-precipitation (mi rendo conto che è un po’ riduttivo spiegata in questo modo; chi volesse spaerne di più chieda pure). L’esperimento è stato condotto in triplice copia, in modo da ottenere una media dei risultati. La stragrande maggioranza delle sequenze trovate localizza nelle vicinanze del TSS del gene o comunque in una regione di 2.5 Kb.
Non per tutte le sequenze è stato possibile trovare una evidenza bioinformatica. Per queste sequenze è stato condotto un test sperimentale associandole a dei geni la cui espressione può essere monitorata facilmente (geni reporter) ad esempio la GFP. In questo modo è stato possibile dimostrare che molte di queste sequenze erano degli effettivi promotori perchè permettevano l’espressione del gene reporter. Quelle sequenze che nemmeno in questo modo sono risultate essere dei promotori, molto probabilmente sono dei falsi positivi.
In questo modo sono stati identificati diversi promotori che prima non si conoscevano.
Dicevo poco fa che i promotori del modello TATAbox sono riduttivi. Qual’è quindi il nuovo modello di promotore che ha soppiantato quello vecchio? Nella stragrande maggioranza dei casi (una stima dell’82%) i promotori sono cosiddetti CG rich. Ovvero non hanno una sequenza definita, ma sono molto ricchi (statisticamente più della media) di CG e sono estremamente più variabili. Sono chiamati Broad spectrum promoters poichè al contrario dei promotori TATAbox non fanno partire la trascrizione da un TSS singolo. ovvero I geni che sono sotto questi promotori sono trascritti a partite da TSS diversi. Gli RNAmessaggeri derivanti avranno quindi un sito di inizio differente (il che non vuol dire necessariamente che la proteina codificante sarà poi diversa, perchè un conto è il Sito di Inizio della Tracrizione, un altro conto è il Sito di Inizio della Traduzione: tra i due c’è una regione chiamata 5′-UTR). Questo ha un suo senso. Nel post sull’evoluzione del concetto di gene che ho scritto qualche mese fa ho detto che attualmente si stima che la maggiorparte dei geni possono essere letti in maniera differente dando origine a prodotti diversi. Variare il sito di inizo è una delle vie per rendere possibile ciò.
Questi promotori possono anche essere bidirezionali, ovvero dare origine a trascritti a partire da entrambi i filamenti del DNA nelle due opposte direzioni.
Ora che abbiamo un’idea sulla complessità dei promotori, possiamo addentrarci sulla loro funzione.
Abbiamo detto che su questi promotori si legano delle proteine, i fattori di trascrizione. Ad oggi sono stati identificati circa 1400 diversi tipi di fattori di trascrizione, molti dei quali sono tessuto specifici. Hanno dei domini che legano sequenze di DNA. Legandosi a queste sequenze innescano un meccanismo di Reclutamento di altre proteine le quali attivamente modificano lo stato degli istoni attraverso acetilazioni/deacetilazioni, metilazioni/demetilazioni e altre modificazioni covalenti. La modificazione degli istoni rende possibile o impossibile alla RNApolimerasi di di legarsi al DNA regolandone lo stato di avvolgimento e superavvolgimento sugli Istoni. Attraverso quindi modificazioni epigenetiche si rende possibile o meno l’espressione genica. Sono stati fatti dei lavori, uno in particolare molto bello, sul reclutamento di proteine modificatrici della cromatina a livello dei siti di legame di alcuni fattori di trascrizione, in particolare il recettore per gli estrogeni. Attraverso studi di chromatine immune precipitation si è visto che nella maggiorparte dei casi il reclutamento segue dei cicli temporali predefiniti e discreti, e non è quindi un processo continuo. C’è quindi anche un aspetto temporale e spaziale da definire. Questo rende la faccenda molto intrigante.
Concludo con una considerazione. I fattori di trascrizione regolano l’equilibrio vitale di una cellula. Ognuna delle cellule di un tessuto esprime un suo pattern di fattori di trascrizone, che non è detto che sia identico per ogni cellula di quel tessuto. C’è anche da tener conto dell’identità specifica di ogni cellula. Modificazioni dell’attività dei fattori di trascrizione possono portare allo svliluppo di neoplasie per motivi evidenti. E’ noto il ruolo dei fattori di trascrizione noti come recettori degli estrogeni nello sviluppo del cancro alla mammella. Il Tamoxifen è un farmaco storico che inibisce questi fattori di trascrizione ottenendo dei buoni risultati!

Con questo è tutto, alla prossima.

Il progetto genoma ha 10 anni

Manuel — Wed, 07 Jul 2010 21:14:32 +0000

In realtà ne ha molti di più, contando che il 22 giugno 2000 che è stata pubblicata la sequenza del genoma umano, ma per giungerci sono stati impiegati diversi anni!

A questo proposito volevo consigliarvi lo speciale del numero di Nature appena uscito; Si tirano le somme, si fa il punto della situazione e si esaminano i problemi! Da non perdere.

Imprinting!

Manuel — Sun, 07 Mar 2010 16:55:25 +0000

Nonostante il titolo, non dovreste lasciarvi ingannare oramai, perchè dovreste sapere dove vado a parare di solito. Questo non è un post di etologia, ma di biologia molecolare e genetica.
Fino a qualche anno da si riteneva che in un organismo le due metà del patrimonio genetico derivanti dai due genitori contribuissero egualmente, ma si è scoperto che non è così. Per un gruppo di geni fare parte della linea materna o paterna è di fondamentale importanza per la sua futura attività.
L’imprinting è un termine che comunque è stato mutuato dall’etologia e indica proprio questo aspetto: un piccolo insieme di geni sono espressi esclusivamente dalla linea materna o dalla linea paterna e mai dall’altra. Non è incredibile? Questo fenomeno non è casuale, nel senso che geni che hanno un imprinting materno (che sono cioè espressi soltanto dall’allele di derivazione materna) conservano lo stesso imprinting in tutti gli organismi della stessa specie e probabilmente anche nelle specie affini. Molti dei geni “imprinted” nell’uomo, ad esempio, hanno lo stesso imprinting anche nel topo! In generale il fenomeno dell’imprintig è abbastanza conservato in tutti i mammiferi, ma è stato osservato ovunque negli eucarioti.
Non so se riusciate a comprendere la portata del fenomeno. Come diavolo possono essere distinti i geni in base linea parentale di appartenenza? Come è possibile che sempre lo stesso allele venga espresso? Sembra ovvio che non può essere questione di diversità di sequenza, perchè gli alleli sono in teoria identici.
Quindi ci deve essere qualcos’altro all’origine di questo strano fenomeno che viene trasmesso di generazione in generazione. Ci deve essere un modo per marcare il DNA in modo da poter identificare i geni in questione e soprattutto questa marcatura deve essere trasmessa di generazione in generazione.
A questo punto devo introdurre un concetto abbastanza complicato e che se anche all’inizio sembrerà che non c’entri nulla con quanto ho appena detto, in realtà è un passaggio fondamentale.
Tutti conosciamo il codice genetico, ma pochi conoscono il codice epigenetico. Il termine epigenetica indica un insieme di fenomeni che in qualche modo “stanno sopra” la genetica. Cosa vuol dire stare sopra? Non che sia più importante, ma soltanto che mentre il codice genetico si basa sulle sequenze nucleotidiche, le quali codificano informazioni ben precise come ben sappiamo, il codice epigenetico è un codice che non si basa sulle sequenze ma su altri elementi che adesso in breve spiegherò.
Questi elementi possono essere a carico del DNA stesso, come la metilazione (aggiunta di un gruppo -CH3) su entrambi i filamenti delle citosine in contesto CG; oppure possono essere a carico di una famiglia di proteine che interagiscono direttamente e fisicamente con il DNA e influenzano in modo determinante la trascrizione ed altri processi: gli istoni.
Cerco di spiegarmi meglio; il codice epigenetico è una sorta di linguaggio (come il codice genetico) e porta informazioni ben precise e fondamentali per lo sviluppo e la corretta funzione di una cellula. Questo linguaggio è costituito da un “alafabeto” che consiste principalmente in metilazione delle citosine in 5-metil-citosina quando le C sono precedute e/o seguite da una G. Questa metilazione avviene su entrambi i filamenti ad opera di una famiglia di enzimi chiamati DNMT (DNA-metil-transferasi). La metilazione sembra una modificazione insignificante, ma in realtà influenza pesantemente la struttura e la funzione del DNA.Diverse proteine si legano alle sequenze metilate e fanno in modo che il DNA assuma una conformazione densa e compatta e pressochè inattiva (eterocromatina). La metilazione non è l’unico elemento epigenetico, ma è l’unico ad interessare direttamente il DNA. Le altre modificazioni interessano delle proteine che sono strettamente associate al DNA gli istoni. Gli istoni sono le proteine che più frequentemente troviamo associate al DNA, il quale si avvolge letteralmente sopra. A seconda di come sono modificati gli istoni, il DNA può essere rilassato e attivo, oppure compatto ed inattivo. Però cosa si intende per compatto e per rilassato? Il DNA è approssimativamente un filo, quando è ripiegato tante volte su se stesso ed associato molto strettamente agli istoni allora è compatto; quando si trova in questo stato il DNA è inattivo perchè le proteine che sono necessarie alla trascrizione non riescono a legarsi all DNA stesso. Se invece il DNA è lineare è attivo perchè non ci sono ostacoli alla trascrizione.
Concentriamoci sulla metilazione delle citosine. Questa è l’unica modificazione che viene trasmessa e mantenuta da una cellula all’altra durante la divisione, ed è la responsabile della memoria cellulare! Cosa vuol dire? Vi siete mai chiesti come faccia una cellula già differenziata rimanere tale dopo la divisione cellulare? Come fa una cellula a sapere da che cellula deriva? Ricordatevi che una cellula quando si divide, replica e condensa tutti i cromosomi e li divide equamente tra le cellule figlie; queste ultime, una volta separate, decondensano i cromosomi e pertanto potrebbero in teoria decondensare ed attivare anche regioni che normalmente non dovrebbero essere attive in una cellula di quel tipo e diventare altre cellule. Come fanno a sapere cosa attivare e cosa no? Ok, mi direte voi, dal contesto e dal tessuto in cui si trova (se si trova in mezzo a epatociti diventerà epatocita); non è errata come risposta, ma non è sufficiente. E’ la metilazione che guida la memoria cellulare. Regioni metilate ed inattive nella cellula madre, saranno tenute metilate anche nelle cellule figlie, ad opera delle DNMT. Una cellula replica il suo DNA in maniera semiconservativa, pertanto le due copie di DNA che si formano avranno un filamento “vecchio” della cellula madre ed il complementare è invece appena sintetizzato. Pertanto le cellule figlie avranno soltanto un filamento di DNA che continua ad essere metilato, quello della madre, mentre il complementare no! le DNMT riconoscono lecitosine in contesto CG metilate solo su un filamento e le metilano anche nel filamento complementare, mantenendo così intantta la meoria cellulare. Interessante non è vero???
Ok, spero di non avervi confuso le idee con questa digressione. Spero non abbiate perso il punto principale, ovvero l’imprinting. Ci eravamo chiesti quale “marcatura” potesse essere in grado di differenziare un allele dall’altro e che fosse in grado di trasmettersi lungo le generazioni. Come avrete già capito, questa marcatura è proprio la metilazione delle citosine. A questo punto si apre un problema. E’ noto che durante lo sviluppo embrionale sono le cellule staminali embrionali che danno origine all’individuo. Le cellule staminali embrionali (CSE) sono dedifferenziate e possono dare origine a qualsiasi cellula. Questo è possibile perchè il DNA dello zigote non appena c’è stata la fecondazione va incontro ad un ampio riarrangiamento e viene praticamente “demetilato” per cancellare la memoria cellulare e dare origine alle CSE. A questo seguirà una ondata di metilazione “de novo” che permetterà alle cellule di differenziarsi man mano che procede lo sviluppo. Non si conoscono ancora bene i meccanismi di questa nuova ondata di metilazione, però sta di fatto che se le metilazioni originali vanno perdute, come si fa a ristabilire l’imprinting nel modo corretto? Questo è possibile perchè non tutte le metilazioni vanno perdute, e tra le metilazioni che rimangono, ci sono quelle che regolano l’imprinting e pertanto questo viene conservato durante le generazioni.
Ora che abbiamo capito la logica che ci sta dietro, vediamo come sono regolati questi “imprinted genes”. E’ stato notato che c’è una regione di DNA che può anche essere condivisa da più geni che può essere metilata o non metilata. Questa regione che può anche essere molto lunga è chiamata ICR (imprinted control region). E’ questa regione che è differentemente marcata tra le due linee parentali. Se è metilata su una linea non è metilata nell’altra. Solitamente le regioni metilate sono inattive, quindi la ICR metilata sarà un segnale di silenziamento genico. Il discorso è però più complicato, perchè esistono due tipi di ICRs, ma non mi sembra il caso di addentrarmi ulteriormente.. mi sembra di aver messo già troppa carne al fuoco.

Spero di essere stato chiaro e non confusionario. spero di aver reso l’idea di quello che volevo dire! Se avete domande ovviamente siete caldissimamente invitate a farle. Così pure se volete semplicemente commentare o criticare!

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Confini e Territori

Manuel — Thu, 18 Feb 2010 21:46:00 +0000

Molto spesso nei libri di testo di biologia molecolare si trova pochissimo spazio dedicato a fenomeni che mi sembrano di grandissima rilevanza nella comprensione di molti processi. Probabilmente questo è dovuto al fatto che sovente non si hanno sufficienti informazioni, oppure se ce ne sono appaiono contraddittorie.
In questo piccolo intervento volevo parlare di una cosa secondo me di un interesse sconvolgente: l’organizzazione tridimensionale del genoma. Detto così non mi sembra di essere stato molto chiaro; cercherò di rifarmi qui di seguito.
Probabilmente molti di voi sono a conoscenza del fatto che la più grande unità organizzativa del genoma, eucariotico per lo più, è il cromosoma. Negli eucarioti ciascun cromosoma occupa un particolare volume nel nucleo cellulare chiamato territorio cromosomale e quel che più importa questo territorio, nel nucleo di una cellula in interfase, non è casuale.
Diversi lavori, tra cui uno in particolare a cui mi sto riferendo, hanno dimostrato che i diversi cromosomi di topo hanno un posizionamento tessuto-specifico all’interno del nucleo cellulare, con i cromosomi particolarmente ricchi di geni disposti verso il centro e quelli poveri di geni verso la periferia. Solitamente, inoltre, la maggior parte dei cromosomi disposti in periferia, erano per la maggior parte condensati in eterocromatina (e quindi trascrizionalmente inattivi).
La disposizione specifica dei cromosomi ha ancora degli aspetti poco chiari. Funzionalmente sembrerebbe servire per ottimizzare la regolazione dell’espressione genica, facendo in modo che geni che devono essere trascritti simultaneamente si trovino nella stessa area, aumentando così le probabilità che la trascrizione non solo avvenga, ma anche nei tempi corretti. Questo perché i geni trascritti intensamente si localizzano nelle cosiddette “fabbriche di trascrizione” (trascriptional factories suona meglio) che sono zone in cui la concentrazione di RNA polimerasi II e di fattori di trascrizione è particolarmente alta. Queste factories sembrano essere meno dei geni attivamente trascritti, pertanto è utile alla cellula localizzare tutti i geni utili in queste zone.
L’aspetto veramente interessante secondo me viene adesso: diversi geni, ma sarebbe più appropriato dire diversi loci, possono in qualche modo allontanarsi dal territorio del cromosoma di appartenenza, pur facendone ancora parte! Non so se sono stato chiaro; immaginate di avere dei gomitoli (supponendo che ciascun gomitolo sia fatto da un unico filo molto lungo e altamente convoluto) posizionati e fissi: questi sono i nostri cromosomi; ora prendete un ansa di filo di un gomitolo e tiratela in modo da farla districare dal resto per avere un loop fisicamente distante dal gomitolo di appartenenza, ma senza che ne sia staccato.
Quindi i cromosomi non solo non sono più entità fisse e statiche, ma i loro territori e i loro confini non sono più così netti come si pensava!
Alcuni cluster di loci, dove per cluster si intende gruppo, pur trovandosi su cromosomi differenti, riescono ad allontanarsi dal territorio di appartenenza, avvicinarsi, ed essere trascritti insieme, soprattutto se sono geni la cui funzione è correlata. Inoltre, che questo evento, di cui ci sono ancora diversi lati oscuri, sia almeno in parte correlato all’attivazione/repressione trascrizionale sembra essere dimostrato dal fatto che, inibendo la RNA polimerasi II, diminuisce significativamente.
Un fenomeno molto interessante che si è osservato, inoltre, riguarda il cromosoma X inattivato. Forse alcuni di voi sapranno che in cellule in cui è presente più di un cromosma X, (quindi negli esseri umani esclusivamente nelle femmine), solo uno di questi è attivo, mentre l’altro (o gli altri) è inattivato in maniera pressochè irreversibile. L’inattivazione del cromosoma X in più avviene attraverso una condensazione del DNA molto accentuata (eterocromatina); questa condensazione fa sì che i geni in questione non vengano trascritti. Quello che si è notato è che alcuni loci del cromosoma X inattivato sfuggono a questa condensazione proprio perché “scappano” dal territorio cromosomale. In questo modo evitano il silenziamento e sono belli attivi. Questo porta a dire due cose: la prima è che i geni, i loci in generale, non sono fissi, si muovono, si spostano all’interno del nucleo (pur rimanendo sempre al loro posto nel cromosoma); se questo movimento sia attivo o passivo non si sa. Al momento ignoro anche se sono stati scoperti dei “motori molecolari” che eseguono questo spostamento.
La seconda cosa, forse ancora più importante è che spesso si tende ad ignorare una cosa in biologia: il contesto spazio/temporale. Gli eventi, i processi che si svolgono sono influenzati sia dal tempo (nel senso che un evento non ha le stesse probabilità di avvenire in ogni istante, ma avrà dei momenti in cui le probabilità saranno maggiori o minori) che dallo spazio: in questo caso abbiamo visto come l’attivazione dei geni sia dovuta al luogo ed al momento in cui si vengono a trovare. Questo sembra banale, però io personalmente non ho quasi mai visto sui testi un accenno a queste due variabili, che pure, voglio dire, sono di fondamentale importanza.

Come sempre, spero di non avervi annoiato. Scrivete commenti e se avete qualsiasi osservazione o critica da fare, fatela!

Al prossimo post (chissà, magari varierò un po’ ..)

Biologi al lavoro: La PCR

Manuel — Sun, 03 Aug 2008 19:25:40 +0000

PCR è un acronimo che sta per Polymerase Chain Reaction, che per un italiano suonerebbe come reazione a catena della polimerasi. Ideata nel 1983 da un tale chiamato Kary Mullis. Questa scoperta che gli valse il premio Nobel nel 1993 è diventata oramai una tecnica fondamentale sia nella ricerca che nella diagnostica molecolare. Un biologo non può non saper fare una PCR.
Quello che una reazione di PCR fa è amplificare esponenzialmente una sequenza specifica di DNA o RNA. Ciò che dobbiamo capire è primo, come fa ad amplificare una sequenza specifica di DNA o RNA, e secondo, a cosa serve amplificare. Ma con calma, ogni cosa a suo tempo.
Innanzitutto occorrono alcune informazioni preliminari sulla struttura del DNA. La struttura del DNA (scoperta da Watson e Crick, i quali a loro volta si sono basati su degli esperimenti fatti da Rosalind Franklin) è a doppio filamento (double strand), i quali si avvolgono appaiandosi in una doppia elica destrorsa. Il DNA è un polimero, ovvero una macromolecola ottenuta legando assieme unità fondamentali, detti monomeri. Tutte le macromolecole biologiche sono polimeri (Acidi Nucleici, Carboidrati, Proteine) tranne i Lipidi. I monomeri del DNA, le sue unità fondamentali, sono i Nucleotidi; un Nucleotide è costituito da uno zucchero a 5 atomi di carbonio (un pentoso) in conformazione ciclica in cui il primo carbonio 1 si lega con il carbonio 4, formando quindi un anello carbonioso. Lo zucchero in questione è il desossiribosio. Al carbonio 1 dello zucchero (chiamato 1′, si legge uno primo) si lega una base azotata (A, T, C, G) che costituisce la sola parte variabile del nucleotide, al carbonio 5′ (cinque primo) si lega un gruppo fosfato (che conferisce tra l’altro l’acidità al DNA). Una cosa importante da sapere è che se il carbonio 1′ si lega alla base e quello 5′ al gruppo fosfato, i rimanenti carbonio 2′ e carbonio 3′ sono liberi (il 4, come ho detto, è impegnato con il 1 nel formare lo zucchero ciclico). Mentre il carbonio 2′ ha due atomi di idrogeno, il carbonio 3′ ha un atomo di idrogeno legato, assieme ad un gruppo ossidrile Alcolico (-OH). Questo gruppo OH al 3′ sarà molto importante.
In realtà il nucleotide così come l’abbiamo visto esiste solo quando fa già parte della catena di DNA. Quando è libero e deve essere aggiunto, è sottoforma di Nucleoside trifosfato: Il nucleoside (attenzione alla S al posto della T) è lo zucchero più la base al 1′. Un nucleoside trifosfato è un nucleoside a cui si aggiungono tre gruppi fosforici al carbonio 5′ (se finora avete seguito, capirete da soli che un nucleoTide non è altro che un nucleoSide monofosfato). Il nucleoside trifosfato, per essere aggiunto alla catena viene “preso” dall’enzima apposito, DNA polimerasi, il quale utilizza l’energia contenuta nei legami tra i tre gruppi fosforici, e in seguito alla scissione di questi legami, unisce il nucleoside ormai monofosfato con l’OH (ossidrile) libero del carbonio 3′ dello zucchero. Quindi ricaviamo una proprietà fondamentale. un filamento di DNA si assembla montando i monomeri uno dietro l’altro facendo reagire il fosfato al 5′ del nucleotide da aggiungere, al OH al 3′ del nucleotide precedente. In gergo si dice che il DNA si sintetizza in direzione 5′->3′ e non altrimenti. Si deduce anche che Un filamento di N nucleotidi ha due estremità diverse, un’estremità 5′ con un gruppo tri-fosfato libero e l’estremità opposta con il 3′-OH libero. Quando un filamento si accoppia ad un altro filamento per specifico appaiamento di basi ( A con T e C con G) attraverso ponti idrogeno) Questo appaiamento dei due filamenti è Antiparallelo: all’estremità 5′ di un filamento corrisponde l’estremità 3′ del filamento complementare, viceversa per l’estremità 3′ del filamento corrisponde la 5′ dell’altro: per convenzione un filamento singolo si rappresenta con direzionalità 5′->3′.
Sapendo quindi che 1) il DNA è un polimero di nucleotidi 2) i nucleotidi si assemblano in direzione 5′->3′ grazie alla DNA polimerasi e 3) i due filamenti sono antiparalleli, possiamo andare a vedere cos’è la PCR.
La PCR si basa sull’amplificazione per duplicazione dei filamenti di DNA; la tecnica ovviamente si svolge in vitro, ovvero in provetta.
Un’altra cosa che dobbiamo sapere è che questa DNA polimerasi, per iniziare a sintetizzare una molecola di DNA, deve innanzitutto avere il filamento complementare da usare come stampo, e secondo non può iniziare la sintesi di nessun filamento senza un innesco, che in inglese viene chiamato Primer. Un primer è una corta sequenza di nucleotidi a partire dalla quale la DNApol inizia ad attaccare nucleotidi usando un filamento come stampo.
Per amplificare una data sequenza di DNA, quindi, bisogna innanzitutto disegnarsi, grazie ad appositi software due primers. Questi Primers sono appunto degli oligonucleotidi attorno alle 20 paia di basi; questi primers non dovranno essere delle sequenze casuali, ovviamente, ma dovranno essere specifici. Specifici a cosa? Specifici uno ad una regione al 5′ e l’altro a quella al 3′ della sequenza da amplificare.
Questi primer sono complementari alle estremità 3′ della regione del DNA di interesse. In modo che la DNA polimerasi possa usarli per iniziare ad amplificare la regione di DNA compresa tra queste due sequenze.

Il primo primer, chiamato Forward, dovrà essere tale e quale la regione 5′ del filamento superiore, in modo da appaiarsi alla regione 3′ del filamento inferiore. In questo modo, questo primer permetterà alla DNApol di sintetizzare il filamento superiore, usando come stampo il filamento inferiore. Il secondo primer, chiamato Reverse, dovrà permettere la sintesi del filamento inferiore usando come stampo il filamento superiore, e pertanto dovrà essere complementare alla regione 3′ del filamento superiore. Avremo quindi secondo questo schema:

Notare il primer forward che si lega alla regione 3′ del filamento inferiore e che permette la trascrizione del filamento superiore. e il primer Reverse che è esattamente l’opposto. In questo modo la DNA polimerasi riesce a copiare la sequenza originale e a duplicarla. La PCR è una tecnica che si compone di Cicli di amplificazione, e in ogni ciclo la quantità della sequenza approssimativamente raddoppia. Ogni ciclo di amplificazione è caratterizzato da delle specifiche temperature, che permettono la corretta esecuzione della reazione. Ogni ciclo è così composto (Rifatevi alla figura per capire):

Step 1:alla temperatura di circa 90-94 °C i due filamenti di separano per il calore (Temp di Melting)

Step 2: alla temperatura di 55-60°C I primers si appaiano ai filamenti principali (Temp di Annealing)

Step 3: alla temperarura di 70°C la DNA polimerasi estende i primers e sintetizza la sequenza! (Temp di Extension).

Ovviamente date le temperature elevate, una DNApol normale non funzionerebbe, pertanto si utilizzano delle DNApol ottenute da batteri che vivono ad esempio, in sorgenti termali, e che lavorano a T molto alte (>70 °C). Ad esempio la Taq polimersi è ottenuta dal Batterio Termale Thermus Aquaticus (da cui Taq).
Abbiamo quindi capito che per fare una PCR servono: DNA da amplificare, Primers FWD e REV, Taq Polimerasi, Nucleosidi Trifosfati, alcuni ioni come Mg per stabilizzare l’enzima e infine Acqua. Il tutto in una provetta, che verrà messa in un apposita macchina che alternerà le giuste temperature. Di solito i cicli di amplificazione variano da 30 a 40 e le Temperature e i tempi possono essere aggiustati. Ovviamente le concentrazioni di ciascun reagente non sono fisse, ma possono essere regolate a seconda dei casi. Ad esempio, se abbiamo una sequenza molto lunga da amplificare (> 2000 paia di basi) sarà necessario dare più tempo alla fase di extension, per permettere alla Taq polimerasi di completare la sequenza prima dell’inizio di un nuovo ciclo. Saremmo anche portati ad aumentare i Nucleosidi trifosfato, ma attenzione, oltre una certa concentrazione i nucleosidi trifosfato inibiscono la reazione perchè catturano (chelano) il Mg che serve alla Taq.
Cio che la PCR può fare l’abbiamo visto. Ora capiamo perchè vogliamo farlo. La PCR è una tecnica molto generica, e proprio per questo può essere applicata ad un’infinità di studi. Dagli studi clinici, dove si può utilizzare per scoprire se dei pazienti con un determinato profilo clinico abbiano una mutazione a livello di un particolare gene. Io amplifico la regione del gene (in genere un esone) in cui credo ci sia una mutazione, e successivamente vado a sequenziare il prodotto di PCR. In questo modo vedrò il genotipo dei pazienti. Alle indagini della polizia scientifica, in cui tracce di DNA vengono usate per inchiodare o no un sospettato. Dalle tracce del DNA io amplifico determinate regioni ipervariabili (che variano cioè da persona a persona) e le sequenzio e le vado a confrontare con quelle del sospettato. Se c’è corrispondenza totale allora siamo di fronte allo stesso individuo (Idem per il test di Paternità). Infine, per la ricerca, la PCR è una tecnica insostituibile (Così come molte altre). Se voglio vedere quanto è espresso un gene, vado ad amplificare e a quantificare il suo RNA messaggero. e di esempi ne potrei fare a milioni. C’è sempre il problema della specificità e della contaminazione. Bisogna fare attenzione perchè se i primers non hanno una specificità totale, possiamo amplificare anche prodotti aspecifici. Questo posso vederlo attraverso una Elettroforesi: se trovo una banda delle dimensioni dell’amplificato e solo quella, ho ottime probabilità di avere amplificato la cosa giusta. Se invece trovo bande insolite potrebbero essere aspecificità. E’ anche vero che non sempre io so che cosa aspettarmi, e quindi diventa più difficile capire cosa ho amplificato. Per quanto riguarda le contaminazioni, si usa sempre fare almeno un conrollo negativo (in cui metto tutto, tranne il DNA da amplificare) e vedo attraverso una elettroforesi che cosa mi viene. Se non ho contaminazioni, questo controllo mi deve venire vuoto, ovvero non deve vedere nessuna banda (è possile vedere una banda molto piccola attorno ai 30bp, ma questi sono soltanto i primers che si sono accoppiati, i cosiddetti primer dimer). Se mi viene una banda, questa è senz’altro una contaminazione. Questa contaminazione o è un DNA sconosciuto, oppure spesso, è una contaminazione da uno degli altri campioni che si allestiscono (sono i più vicini ed è più probabile che siano loro la fonte di contaminazione). Ovviamente se così fosse, dovrei avere una banda paragonabile a quelle ottenute in questi campioni (ovviamente io parlo di bande, ma mi riferisco ovviamente alle bande che ottengo facendo correre le reazioni di PCR in un gel per elettroforesi, e per capire andare sul link che ho messo prima).
La PcR è una tecnica che amplifica, avrete capito, in modo esponenziale una sequenza. Se parto da una sequenza di partenza, dopo un ciclo ne avrò due, dopo due cicli ne avrò quattro, (X^n dove X è il numero di sequenze iniziali e n è il numero di cicli). Bisogna dire che non è sempre così, ovvero, solo in una periodo la reazione ha questo andamento, e non è neppure detto che abbia un’efficienza del 100% (principalmente il maggiore ostacolo è la durata della Taq polimerasi, sebbene sia stata progettata per funzionare ad alte temperature, dopo un tot di cicli inizia a diminuire la sua funzionalità; inoltre la concentrazione dei reagenti diminuisce progressivamente). Quindi bisogna fare attenzione.
Con questo è tutto. Spero vi abbia interessato e vi sia stato utile! se avete dubbi, domande o se notate errori usate i commenti! Non esitate!