In realtà ne ha molti di più, contando che il 22 giugno 2000 che è stata pubblicata la sequenza del genoma umano, ma per giungerci sono stati impiegati diversi anni!

A questo proposito volevo consigliarvi lo speciale del numero di Nature appena uscito;  Si tirano le somme, si fa il punto della situazione e si esaminano i problemi! Da non perdere.

Nonostante il titolo, non dovreste lasciarvi ingannare oramai, perchè dovreste sapere dove vado a parare di solito. Questo non è un post di etologia, ma di biologia molecolare e genetica.
Fino a qualche anno da si riteneva che in un organismo le due metà del patrimonio genetico derivanti dai due genitori contribuissero egualmente, ma si è scoperto che non è così. Per un gruppo di geni fare parte della linea materna o paterna è di fondamentale importanza per la sua futura attività.
L’imprinting è un termine che comunque è stato mutuato dall’etologia e indica proprio questo aspetto: un piccolo insieme di geni sono espressi esclusivamente dalla linea materna o dalla linea paterna e mai dall’altra. Non è incredibile? Questo fenomeno non è casuale, nel senso che geni che hanno un imprinting materno (che sono cioè espressi soltanto dall’allele di derivazione materna) conservano lo stesso imprinting in tutti gli organismi della stessa specie e probabilmente anche nelle specie affini. Molti dei geni “imprinted” nell’uomo, ad esempio, hanno lo stesso imprinting anche nel topo! In generale il fenomeno dell’imprintig è abbastanza conservato in tutti i mammiferi, ma è stato osservato ovunque negli eucarioti.
Non so se riusciate a comprendere la portata del fenomeno. Come diavolo possono essere distinti i geni in base linea parentale di appartenenza? Come è possibile che sempre lo stesso allele venga espresso? Sembra ovvio che non può essere questione di diversità di sequenza, perchè gli alleli sono in teoria identici.
Quindi ci deve essere qualcos’altro all’origine di questo strano fenomeno che viene trasmesso di generazione in generazione. Ci deve essere un modo per marcare il DNA in modo da poter identificare i geni in questione e soprattutto questa marcatura deve essere trasmessa di generazione in generazione.
A questo punto devo introdurre un concetto abbastanza complicato e che se anche all’inizio sembrerà che non c’entri nulla con quanto ho appena detto, in realtà è un passaggio fondamentale.
Tutti conosciamo il codice genetico, ma pochi conoscono il codice epigenetico. Il termine epigenetica indica un insieme di fenomeni che in qualche modo “stanno sopra” la genetica. Cosa vuol dire stare sopra? Non che sia più importante, ma soltanto che mentre il codice genetico si basa sulle sequenze nucleotidiche, le quali codificano informazioni ben precise come ben sappiamo, il codice epigenetico è un codice che non si basa sulle sequenze ma su altri elementi che adesso in breve spiegherò.
Questi elementi possono essere a carico del DNA stesso, come la metilazione (aggiunta di un gruppo -CH3) su entrambi i filamenti delle citosine in contesto CG; oppure possono essere a carico di una famiglia di proteine che interagiscono direttamente e fisicamente con il DNA e influenzano in modo determinante la trascrizione ed altri processi: gli istoni.
Cerco di spiegarmi meglio; il codice epigenetico è una sorta di linguaggio (come il codice genetico) e porta informazioni ben precise e fondamentali per lo sviluppo e la corretta funzione di una cellula. Questo linguaggio è costituito da un “alafabeto” che consiste principalmente in metilazione delle citosine in 5-metil-citosina quando le C sono precedute e/o seguite da una G. Questa metilazione avviene su entrambi i filamenti ad opera di una famiglia di enzimi chiamati DNMT (DNA-metil-transferasi). La metilazione sembra una modificazione insignificante, ma in realtà influenza pesantemente la struttura e la funzione del DNA.Diverse proteine si legano alle sequenze metilate e fanno in modo che il DNA assuma una conformazione densa e compatta e pressochè inattiva (eterocromatina). La metilazione non è l’unico elemento epigenetico, ma è l’unico ad interessare direttamente il DNA. Le altre modificazioni interessano delle proteine che sono strettamente associate al DNA gli istoni. Gli istoni sono le proteine che più frequentemente troviamo associate al DNA, il quale si avvolge letteralmente sopra. A seconda di come sono modificati gli istoni, il DNA può essere rilassato e attivo, oppure compatto ed inattivo. Però cosa si intende per compatto e per rilassato? Il DNA è approssimativamente un filo, quando è ripiegato tante volte su se stesso ed associato molto strettamente agli istoni allora è compatto; quando si trova in questo stato il DNA è inattivo perchè le proteine che sono necessarie alla trascrizione non riescono a legarsi all DNA stesso. Se invece il DNA è lineare è attivo perchè non ci sono ostacoli alla trascrizione.
Concentriamoci sulla metilazione delle citosine. Questa è l’unica modificazione che viene trasmessa e mantenuta da una cellula all’altra durante la divisione, ed è la responsabile della memoria cellulare! Cosa vuol dire? Vi siete mai chiesti come faccia una cellula già differenziata rimanere tale dopo la divisione cellulare? Come fa una cellula a sapere da che cellula deriva? Ricordatevi che una cellula quando si divide, replica e condensa tutti i cromosomi e li divide equamente tra le cellule figlie; queste ultime, una volta separate, decondensano i cromosomi e pertanto potrebbero in teoria decondensare ed attivare anche regioni che normalmente non dovrebbero essere attive in una cellula di quel tipo e diventare altre cellule. Come fanno a sapere cosa attivare e cosa no? Ok, mi direte voi, dal contesto e dal tessuto in cui si trova (se si trova in mezzo a epatociti diventerà epatocita); non è errata come risposta, ma non è sufficiente. E’ la metilazione che guida la memoria cellulare. Regioni metilate ed inattive nella cellula madre, saranno tenute metilate anche nelle cellule figlie, ad opera delle DNMT. Una cellula replica il suo DNA in maniera semiconservativa, pertanto le due copie di DNA che si formano avranno un filamento “vecchio” della cellula madre ed il complementare è invece appena sintetizzato. Pertanto le cellule figlie avranno soltanto un filamento di DNA che continua ad essere metilato,  quello della madre, mentre il complementare no! le DNMT riconoscono lecitosine in contesto CG metilate solo su un filamento e le metilano anche nel filamento complementare, mantenendo così intantta la meoria cellulare. Interessante non è vero???
Ok, spero di non avervi confuso le idee con questa digressione. Spero non abbiate perso il punto principale, ovvero l’imprinting. Ci eravamo chiesti quale “marcatura” potesse essere in grado di differenziare un allele dall’altro e che fosse in grado di trasmettersi lungo le generazioni. Come avrete già capito, questa marcatura è proprio la metilazione delle citosine. A questo punto si apre un problema. E’ noto che durante lo sviluppo embrionale sono le cellule staminali embrionali che danno origine all’individuo. Le cellule staminali embrionali (CSE) sono dedifferenziate e possono dare origine a qualsiasi cellula. Questo è possibile perchè il DNA dello zigote non appena c’è stata la fecondazione va incontro ad un ampio riarrangiamento e viene praticamente “demetilato” per cancellare la memoria cellulare e dare origine alle CSE. A questo seguirà una ondata di metilazione “de novo” che permetterà alle cellule di differenziarsi man mano che procede lo sviluppo. Non si conoscono ancora bene i meccanismi di questa nuova ondata di metilazione, però sta di fatto che se le metilazioni originali vanno perdute, come si fa a ristabilire l’imprinting nel modo corretto? Questo è possibile perchè non tutte le metilazioni vanno perdute, e tra le metilazioni che rimangono, ci sono quelle che regolano l’imprinting e pertanto questo viene conservato durante le generazioni.
Ora che abbiamo capito la logica che ci sta dietro, vediamo come sono regolati questi “imprinted genes”.  E’ stato notato che c’è una regione di DNA che può anche essere condivisa da più geni che può essere metilata o non metilata. Questa regione che può anche essere molto lunga è chiamata ICR (imprinted control region). E’ questa regione che è differentemente marcata tra le due linee parentali. Se è metilata su una linea non è metilata nell’altra. Solitamente le regioni metilate sono inattive, quindi la ICR metilata sarà un segnale di silenziamento genico.  Il discorso è però più complicato, perchè esistono due tipi di ICRs, ma non mi sembra il caso di addentrarmi ulteriormente.. mi sembra di aver messo già troppa carne al fuoco.

Spero di essere stato chiaro e non confusionario. spero di aver reso l’idea di quello che volevo dire! Se avete domande ovviamente siete caldissimamente invitate a farle. Così pure se volete semplicemente commentare o criticare!

Molto spesso nei libri di testo di biologia molecolare si trova pochissimo spazio dedicato a fenomeni che mi sembrano di grandissima rilevanza nella comprensione di molti processi. Probabilmente questo è dovuto al fatto che sovente non si hanno sufficienti informazioni, oppure se ce ne sono appaiono contraddittorie.
In questo piccolo intervento volevo parlare di una cosa secondo me di un interesse sconvolgente: l’organizzazione tridimensionale del genoma. Detto così non mi sembra di essere stato molto chiaro; cercherò di rifarmi qui di seguito.
Probabilmente molti di voi sono a conoscenza del fatto che la più grande unità organizzativa del genoma, eucariotico per lo più, è il cromosoma. Negli eucarioti ciascun cromosoma occupa un particolare volume nel nucleo cellulare chiamato territorio cromosomale e quel che più importa questo territorio, nel nucleo di una cellula in interfase, non è casuale.
Diversi lavori, tra cui uno in particolare a cui mi sto riferendo, hanno dimostrato che i diversi cromosomi di topo hanno un posizionamento tessuto-specifico all’interno del nucleo cellulare, con i cromosomi particolarmente ricchi di geni disposti verso il centro e quelli poveri di geni verso la periferia. Solitamente, inoltre, la maggior parte dei cromosomi disposti in periferia, erano per la maggior parte condensati in eterocromatina (e quindi trascrizionalmente inattivi).
La disposizione specifica dei cromosomi ha ancora degli aspetti poco chiari. Funzionalmente sembrerebbe servire per ottimizzare la regolazione dell’espressione genica, facendo in modo che geni che devono essere trascritti simultaneamente si trovino nella stessa area, aumentando così le probabilità che la trascrizione non solo avvenga, ma anche nei tempi corretti. Questo perché i geni trascritti intensamente si localizzano nelle cosiddette “fabbriche di trascrizione” (trascriptional factories suona meglio) che sono zone in cui la concentrazione di RNA polimerasi II e di fattori di trascrizione è particolarmente alta. Queste factories sembrano essere meno dei geni attivamente trascritti, pertanto è utile alla cellula localizzare tutti i geni utili in queste zone.
L’aspetto veramente interessante secondo me viene adesso: diversi geni, ma sarebbe più appropriato dire diversi loci, possono in qualche modo allontanarsi dal territorio del cromosoma di appartenenza, pur facendone ancora parte! Non so se sono stato chiaro; immaginate di avere dei gomitoli (supponendo che ciascun gomitolo sia fatto da un unico filo molto lungo e altamente convoluto) posizionati e fissi: questi sono i nostri cromosomi; ora prendete un ansa di filo di un gomitolo e tiratela in modo da farla districare dal resto per avere un loop fisicamente distante dal gomitolo di appartenenza, ma senza che ne sia staccato.
Quindi i cromosomi non solo non sono più entità fisse e statiche, ma i loro territori e i loro confini non sono più così netti come si pensava!
Alcuni cluster di loci, dove per cluster si intende gruppo, pur trovandosi su cromosomi differenti, riescono ad allontanarsi dal territorio di appartenenza, avvicinarsi, ed essere trascritti insieme, soprattutto se sono geni la cui funzione è correlata. Inoltre, che questo evento, di cui ci sono ancora diversi lati oscuri, sia almeno in parte correlato all’attivazione/repressione trascrizionale sembra essere dimostrato dal fatto che, inibendo la RNA polimerasi II, diminuisce significativamente.
Un fenomeno molto interessante che si è osservato, inoltre, riguarda il cromosoma X inattivato. Forse alcuni di voi sapranno che in cellule in cui è presente più di un cromosma X, (quindi negli esseri umani esclusivamente nelle femmine), solo uno di questi è attivo, mentre l’altro (o gli altri) è inattivato in maniera pressochè irreversibile. L’inattivazione del cromosoma X in più avviene attraverso una condensazione del DNA molto accentuata (eterocromatina); questa condensazione fa sì che i geni in questione non vengano trascritti. Quello che si è notato è che alcuni loci del cromosoma X inattivato sfuggono a questa condensazione proprio perché “scappano” dal territorio cromosomale. In questo modo evitano il silenziamento e sono belli attivi. Questo porta a dire due cose: la prima è che i geni, i loci in generale, non sono fissi, si muovono, si spostano all’interno del nucleo (pur rimanendo sempre al loro posto nel cromosoma); se questo movimento sia attivo o passivo non si sa. Al momento ignoro anche se sono stati scoperti dei “motori molecolari” che eseguono questo spostamento.
La seconda cosa, forse ancora più importante è che spesso si tende ad ignorare una cosa in biologia: il contesto spazio/temporale. Gli eventi, i processi che si svolgono sono influenzati sia dal tempo (nel senso che un evento non ha le stesse probabilità di avvenire in ogni istante, ma avrà dei momenti in cui le probabilità saranno maggiori o minori) che dallo spazio: in questo caso abbiamo visto come l’attivazione dei geni sia dovuta al luogo ed al momento in cui si vengono a trovare. Questo sembra banale, però io personalmente non ho quasi mai visto sui testi un accenno a queste due variabili, che pure, voglio dire, sono di fondamentale importanza.

Come sempre, spero di non avervi annoiato. Scrivete commenti e se avete qualsiasi osservazione o critica da fare, fatela!

Al prossimo post (chissà, magari varierò un po’ ..)

Dopo così tanti post di matematica, fisica e affini è giusto far rilassare il lettore con un post sulla Biologia!

PCR è un acronimo che sta per Polymerase Chain Reaction, che per un italiano suonerebbe come reazione a catena della polimerasi. Ideata nel 1983 da un tale chiamato Kary Mullis, e questa scoperta gli è valsa il premio Nobel nel 1993, la PCR è una pratica che oramai è onnipresente negli studi concernenti la biologia, sia perchè è importantissima sia perchè è facilmente utilizzabile (tant’è che l’ho fatta anch’io nel laboratorio di biologia molecolare).
La PCR è utilizzata per amplificare ed isolare in maniera esponenziale dei segmenti di DNA in vitro, senza l’utilizzo di cellule batteriche.

Poichè in questa società CSI è tanto alla moda, non posso non evidenziare i risvolti polizieschi della PCR, poichè anche solo da una minuscola materiale biologico è possibile amplificare in maniera titanica il DNA, in modo da poterlo analizzare.
Per passare a risvolti più propriamente biologici, è molto importante nello studio della genetica:
sto facendo uno studio di genetica di popolazione, voglio vedere le differenze che intercorrono tra due popolazioni distinte della stessa specie, magari isolate tra di loro, cosa faccio? Semplice, analizzo alcune sequenze genomiche attraverso la PCR, così vedo se magari è in corso un fenomeno di speciazione.  E’ necessario analizzare sequenze genomiche sufficientemente polimorfiche per individuare le differenze; se invece voglio analizzare le parentele tra due specie differenti allora vado a studiare dei segmenti genomici più conservati, per vedere il grado di differenziazione, di solito si utilizzano i geni dell’RNA ribosomiale, che possiedono sequenze altamente conservate e sequenze molto polimorfiche. Non solo, la PCR è utilissima nell’analisi e nello studio delle malattie genetiche (Anemia falciforme, distrofia muscolare, ecc..).

Innanzitutto occorrono alcune informazioni preliminari sulla struttura del DNA. La struttura del DNA (scoperta da Watson (sì, quello che disse poco tempo fa che i neri sono meno intelligenti dei bianchi) e Crick, i quali a loro volta si sono basati su degli esperimenti fatti da Rosalind Franklin) è a doppio filamento, i quali si avvolgono in una doppia elica destrorsa. Un filamento di DNA è costituito dalla ripetizione di nucleotidi; un nucleotide è costituito da uno zucchero a 5 atomi di carbonio, il desossiribosio. Al carbonio 1 dello zucchero (chiamato 1′, si legge uno primo) si lega una base azotata (A, T, C, G) che costituisce la sola parte variabile del nucleotide, al carbonio 5′ (cinque primo) si lega un gruppo fosfato (che conferisce tra l’altro l’acidità al DNA) . Queste unità per formare un filamento si uniscono in modo che il fosfato in 5′ reagisca con il carbonio 3′ dello zucchero precedente. Quindi un filamento di DNA è formato da una successione di nucleotidi. A sua volta un filamento si accoppia ad un altro filamento per specifico appaiamento di basi: A con T e C con G (anche se non si formano legami covalenti ma solo ponti idrogeno). Ne risulta che un filamento è complementare all’altro, e data la sequenza di un filamento si può facilmente risalire alla sequenza del secondo.

Esempio: pATCGTTCTACTAAA il complementare sarà pTTTAGTAGAACGAT

Scritti così, con le informazioni che finora abbiamo non coincidono, ma non sono sbagliati; per capirlo devo però introdurre un’altra caratteristica del DNA, ovvero che i due filamenti sono detti ANTIPARALLELI ovvero che ciascun filamento è dotato di due estremità, un’estremità è quella che corrisponde al carbonio 5′ dello zucchero del primo nucleotide (a cui è legato il gruppo fofato libero, ecco perche nelle due sequenze c’è il p iniziale, indica il fosfato libero) e l’altra quella che corrisponde al carbonio 3′ dell’ultimo nucleotide. All’estremità 5′ di un filamento corrisponde l’estremità 3′ del filamento complementare, viceversa per l’estremità 3′ del filamento corrisponde la 5′ dell’altro: per convenzione un filamento singolo si rappresenta con direzionalità 5′–>3′, e così ho fatto per i due filamenti soprascritti, se ne tenete uno fermo e l’altro lo leggete al contrario sono complementari!
La PCR si basa sull’amplificazione per duplicazione dei filamenti di DNA; la tecnica ovviamente si svolge in vitro: noi abbiamo una provettina dentro la quale, tra le varie cose, inseriamo del DNA al cui interno sappiamo esserci la sequenza che vogliamo amplificare, un enzima capace di duplicare il DNA, chiamato DNA polimerasi (viene preferita una polimerasi termostabile, perchè nella tecnica viene variata la temperatura, estratta da un batterio termofilo: Thermus aquaticus), tutti e quattro i nucleotidi per dare alla polimerasi il materiale per funzionare, degli ioni per far funzionare meglio l’enzima, e poi delle sequenze singole di DNA di circa 20 nucleotidi chiamate primer. Questi primer sono complementari alle estremità 3′ della regione del DNA di interesse, questo perchè la polimerasi per ingranare ha bisogno di un innesco al quale aggiungere sequenzialmente i nucleotidi per la duplicazione. Perchè devono essere complementari all’estremità 3′ del DNA da duplicare? Perchè la polimerasi sintetizza un filamento di DNA in direzione 5′–>3′, pertanto il filamento da duplicare è visto in direzione 3′–>5′. Ora vediamo i singoli passaggi, abbiamo la provetta al completo.

1) alziamo la temperatura a 95°C per far separare i due filamenti del DNA
2) la abbassiamo successivamente a 60°C per permettere ai primer di appaiarsi ciascuno al proprio filamento complementare
3) Viene rialzata a 72°C per far funzionare la polimerasi la quale aggiunge nucleotidi ai primers in direzione 5′–>3′, copiando in questo modo il DNA d’interesse formando nuovi filamenti complementari

Si ripete per diverse volte questo ciclo fino ad amplificare ed isolare i segmenti di interesse!
Qui sotto è mostrato lo schema (lo so, l’ho fatto a mano e lascia a desiderare)

Schema grossolano della PCR

Se doveste notare errori, se voleste fare delle domande o delle precisazioni, scrivete pure nei commenti, altrimenti potete solo anche dire se vi è piaciuto oppure vi ha fatto schifo, sono accette tutte le critiche!