Quello che spiegherò invece è la struttura del genoma retrovirale; un retrovirus ha un genoma a RNA a singolo filamento. Alle estremità di questo filamento ci sono due sequenze terminali diverse, una sequenza terminale 5′ costituita da una regione chiamata R e una regione chiamata U5, e una sequenza terminale 3′, costituita da una sequenza chiamata U3 e una copia identica della sequenza R.

R-U5_________________(RNA a singolo filamento)_______________U3-R

Queste sequenze (R-U5 e U3-R) sono estremamente importanti sia nell’integrazione del genoma virale (retrotrascritto poi in DNA), sia nell’espressione dei geni virali da parte di fattori di trascrizione dell’ospite. Durante la retrotrascrizione, il processo col quale il Genoma virale di RNA a singolo filamento viene trasformato in un genoma a DNA a doppio filamento (leggere il post Retrovirus), vengono aggiunte dei pezzettini al genoma in costruzione, e queste sequenze sono rispettivamente la sequenza U3 al 5′ (prima della sequenza R) e di U5 al 3′, (dopo la sequenza R). In questo modo, quelle che nel genoma a RNA erano sequenze terminali diverse (R+U5 vs U3+R), ora sono diventate delle sequenze terminali identiche (U3-R-U5 e U3-R-U5) Queste sequenze sono chiamate LTR, Long terminal Repeats.

U3-R-U5_____________(DNA a doppio Filamento)______________U3-R-U5

All’interno del genoma, tra queste due LTR ci sono ovviamente i geni retrovirali. I tre geni più importanti sono chiamati Gag, env e pol, che codificano ciascuno per diverse proteine. Il gene gag codifica per le proteine del capside virale, Env codifica per le proteine dell’envelope e Pol codifca per proteine come la retrotrascrittasi, l’integrasi e la proteasi.
La trascrizione di questi geni inizia una volta che il Genoma a DNA si è integrato. I trascritti possono Monocistronici (ovvero contenere un solo gene) oppure policistronici. La maturazione delle proteine virali avviene poi attraverso la proteasi che dai precursori genera le proteine definitive.
Oltre a Gag, Pol e env, ci sono anche altri geni accessori che possono variare da retrovirus a retrovirus, e hanno il compito di facilitare l’operato del virus, molto famosa è, nell’HIV, la proteina Tat, codificata dal gene omonimo, che è un trans-attivatore, ovvero è una proteina che durante la trascrizione del genoma del virus integrato, si lega al trascritto nascente e permette di aumentare l’efficienza della trascrizione stessa consentendo la produzione di trascritti full-lenght, senza questa proteina il virus sarebbe in grado di sintetizzare solo messaggeri troppo corti.

Un vettore retrovirale sfrutta la capactà dei retrovirus di INFETTARE le cellule e di INTEGRARE il loro genoma in quello delle cellule ospiti. In questo modo possiamo trasferire e far esprimere geni che vogliamo ai nostri modelli sperimentali (linee cellulari, animali) in maniera permanente e stabile. Quello che ci serve prima di tutto è quindi il genoma di un retrovirus, all’interno di questo genoma che è solitamente lungo una decina di kilobasi, dobbiamo inserire il gene di interesse. I problemi sono 2, il primo è che la somma tra il genoma retrovirale e il gene di interesse non deve superare una soglia critica, perchè altrimenti il vettore non potrà essere inserito all’interno del virus (capside) stesso per motivi di spazio. Il secondo è che non possiamo lavorare con il genoma ad RNA. Per il primo problema si è fatto sì che si sviluppassero dei vettori retrovirali estremamente ridotti, ovvero contenenti soltanto le LTR terminali ed una sequenza molto importante chiamata di incapsidamento (spiegherò dopo il significato). In questo modo, avendo eliminato tutti i geni retrovirali, io posso inserire all’interno delle LTR il mio gene di interesse. Il secondo problema è stato aggirato lavorando su vettore retrovirale in DNA. Tra tutti i vettori retrovirali, i più diffusi sono quelli lentivirali (i lentivirus sono una sottoclasse dei retrovirus)

In questo Vettore retrovirale abbiamo le due sequenze LTR, e una sequenza Psi che è la sequenza di incapsidamento. Dopodichè abbiamo due geni, uno che codifica una proteina che conferisce resistenza all’ampicillina esterno alle LTR, e un altro che codifica una proteina che conferisce resistenza ad un altro antibiotico, la neomicina che è interno alle LTR e sotto un promotore specifico SV-40 (SV-40 è un promotore appartenente ad un virus delle scimmie, ma non un retrovirus). Che cosa servono questi due geni di resistenza antibiotica? Servono per selezionare. Per iniziare, devo trovare il sistema per inserire il gene di interesse nel vettore di cui vedete sopra un’immagine (esistono tantissimi tipi di vettori retrovirali, e lentivirali in particolar modo). Il modo tradizionale consiste nell’usare degli enzimi di restrizione. Un enzima di restrizione è un enzima che taglia un doppio filamento di DNA, riconoscendo una specifica sequenza. Se io taglio il mio vettore, con un enzima che riconosca una sequenza una sola volta, e che quindi faccia un solo taglio (Per fare questo c’è una mappa di restrizione che indica i diversi siti di taglio presenti sul vettore), e in particolar modo riconosca una sequenza presente nella regione chiamata MCS, io aprirò il mio vettore, lo renderò una molecola di DNA lineare. Il taglio deve generare preferibilmente delle sticky ends, in modo che, usando lo stesso enzima per il mio gene di interesse (facendo attenzione che non lo tagli in mezzo, ma solo alle estremità), Io potrò incastrare il mio gene di interesse all’interno del mio vettore linearizzato proprio perchè avranno le estremità complementari. Legando il mio gene al mio vettore, questo si ricircolarizzerà, generando una molecola di DNA circolare con dentro il mio gene. Il gene è inoltre stato inserito in mezzo alle due LTR retrovirali (perchè ho utilizzato un enzima che tagliasse nel MCS). Ci sono inoltre dei metodi per inserire il gene nella direzione giusta, in modo che sia sotto il controllo del giusto promotore retrovirale (clonaggio direzionale).
Dopodichè si utilizzano dei batteri, all’interno dei quali inseriamo il nostro vettore per aumentarne la quantità. Solo i batteri che hanno assunto il vettore saranno in grado di crescere in un terreno contenente ampicillina, in questo modo io seleziono esclusivamente i batteri che mi servono, quelli che hanno il vettore. La domanda che potreste fare è: ma se visto che ho due geni che danno la resistenza due antibiotici diversi, uno chiaramente per i batteri e l’altro per le cellule eucarioti, sono interscambiabili? Posso cioè utilizzare la neomicina per selezionare i batteri anzichè l’ampicillina? la risposta è no, perchè in questo caso il gene della resistenza alla neomicina è sotto un promotore specifico per le cellule eucarioti, e i batteri non lo leggerebbero, per cui i batteri non sono resistenti alla neomicina, mentre le cellule eucarioti non sono sensibili all’antibiotico ampicillina per cui la selezione invertita non funzionerebbe.
Una volta ottenute grandi quantità di vettore, devo passare allo step successivo. Ovvero creare il retrovirus che contenga come genoma il mio vettore che ho appena costruito. Per fare questo devo tenere conto di diverse cose. innanzitutto, il mio vettore retrovirale, che ho appena costruito da solo non è in grado di produrre nessun virus visto che gli mancano tutti i geni (che gli sono stati tolti per far spazio al gene di mio interesse). Pertanto devo utilizzare un sistema di vicariaggio, ovvero inserire artificilamente il mio vettore appena fatto in cellule apposta (trasfezione). Queste cellule sono chiamate cellule Helper, poichè portano al loro interno tutti i geni retrovirali necessari (gag, env, pol ecc) ma senza la sequenza di incapsidamento. Quindi le cellule helper sono in grado di fornire al mio vettore le proteine neccessarie a integrarsi e trascriversi, sono in grado fabbricare le proteine strutturali virali e quindi di fabbricare il corpo del virus all’interno del quale dovrà incapsidarsi il nostro vettore di interesse. A questo punto entra in gioco il secondo fattore, ovvero la sequenza di incapsidamento: mentre il vettore che contiene il gene di mio interesse contiene la sequenza di incapsidamento, quello che fornisce le proteine retrovirali no, pertanto è impossibile che si vengano a creare dei virus contenenti il vettore con gag env e pol, ma solo quello contenente il gene che voglio. Le cellule Helper sono ottenute infettando delle cellule con un retrovirus privato della sequenza psi; con i primi protocolli accadeva che durante il processo di produzione dei retrovirus, si generassero spontaneamente dei retrovirus replicazione competenti (al contrario di quelli che si volevano ottenere, dei virus replicazione-incompetenti); questa reversione spontanea era dovuta ad eventi di ricombinazione tra il vettore col gene di mio interesse e il vettore con i geni virali standard privato della sequenza psi. Per ovviare a questo problema, si iniziò a transfettare le cellule Helper con vettori separati: uno che codifica per i geni gag-pol, ed un secondo vettore che contiene invece il gene env. Il gene env è molto importante perchè codifica per le proteine di superficie, quelle dell’envelope, che sono le proteine con cui il virus riconosce le cellule e le infetta. Il gene env quindi detrmina la specificità (tropismo) del virus nei confronti dell’ospite. Oltre a questo accorgimento si iniziarono a togliere tutte le sequenze non indispensabili dai vettori helper, per ridurre la probabilità di ricombinazione.
Quindi alla fine della fiera, io inserisco il mio vettore retrovirale nelle cellule helper, e queste cellule helper dopo alcuni giorni di incubazione mi daranno numerose particelle virali contenenti il vettore di mio interesse, anche se sulla totatilità solo una percentuale sarà effettivamente attiva (alcune particelle potranno infatti essere vuote). Io quindi prelevo dal terreno di coltura di queste celluel helper i miei virus, e posso usarlo per infettare le mie cellule. Il virus che ho ottenuto, sarà quindi come stabilito, replicazione incompetente perchè il suo genoma non è in grado di produrre le proteine virali, questo fa sì che quando utilizzerò il virus appena prodotto per infettare le cellule designate, che non sono più cellule helper, ma cellule normali, si avrà soltanto il processo di infezione, di retrotrascrizione e di integrazione del genoma virale e non si avrà nessuna produzione di virus. Ovviamente le cellule da infettare devono essere compatibili con il virus ottenuto, e la compatibilità è data, come ho detto prima, dalle proteine dell’envelope.
Quindi, lo step finale è quello di utilizzare i virus prodotti per infettare le cellule, normalmente quello che si fa è di creare sia un controllo positivo che un controllo negativo. Il controllo positivo può essere un retrovirus contenete nel suo genoma il gene della GFP, in modo che questo renda facile la quantificazione dell’efficienza di infezione (in base al numero di cellule con la fluorescenza verde). Il controllo negativo è un vettore retrovirale vuoto, senza nessun gene inserito, questo serve a controllare gli effetti dell’integrazione casuale che il genoma retrovirale subisce. Inoltre, le cellule infettate col virus vengono fatte crescere in un terreno contenente neomicina (nel caso del vettore in figura), per selezionare solo le cellule che hanno integrato il vettore. Le cellule infettate quindi esprimeranno stabilmente il gene di mio interesse, e il vantaggio di usare vettori retrovirali è che l’efficienza di infezione è molto alta, molto più alta di qualsiasi altro metodo “gene-delivering”.

Ora, per finire, vorrei parlarvi delle apllicazioni pratiche di questo sistema. A cosa mi serve creare dei retrovirus per far esprimere geni di mio interesse? Beh, senz’altro a studiare gli effetti dell’espressione di uno o più geni in un sistema controllato. Ad esempio io trovo che in un particolare tipo di tumore ricorre una particolare mutazione in un gene specifico. Per dimostrare che questa mutazione sia o meno importante nella generazione del tumore, io posso utilizzare dei vettori retrovirali per infettare cellule che non esprimono quel gene con la forma mutata e con la forma standard e osservare le differenze di comportamento nelle cellule infettate.
Un altro campo di applicazione è la cosiddetta Gene-therapy, terapia genica, ovvero il tentativo di curare malattie attraverso l’espressione di geni estranei. Famoso è il caso del deficit di adenosina deaminasi (ADA-deficiency), una malattia genetica che causa una gravissima immunodeficienza congenita. Si è provato a prelevare le cellule staminali emopoietiche di bambini malati, e infettarle con un retrovirus contenente il gene dell’enzima ADA. Straordinariamente le cellule transgeniche, una volta reimmesse nel midollo osseo dei bambini, davano origine a cellule immunitarie funzionanti, eliminando così l’immunodeficienza. Questi sono rari casi di successo nei protocolli di terapia genica attualmente in corso. bisogna sottolineare come, essendo l’integrazione del virus casuale, questo possa rappresentare un rischio di mutagenesi-virus-indotta. Altre applicazioni consistono nell’utilizzare dei vettori retrovirali per far esprimere geni come l’insulina nei diabetici (in corso di sperimentazione), o di utilizzare questi vettori come “bombe” mirate a far suicidare le cellule tumorali (introducendo geni antiproliferativi come p53), il problema è quello di riuscire a costruire dei vettori specifici soltanto per le cellule tumorali.
Concludo con una nota sulla sicurezza in laboratorio durante la produzione di questi virus. Il pericolo maggiore per i ricercatori è quello ovviamente di infettarsi con il virus prodotto, questo ovviamente è tanto più possibile quanto più compatibile è il virus con l’essere umano. Per questo è obbligatorio seguire rigide preocedure di sicurezza (lavorare in laboratori attrezzati specificamente e adibiti apposta, lavorare sempre sotto cappa, indossare mascherina e indumenti protettivi ecc, buon senso)

Spero di non avervi annoiato! Se avete domande, usate i commenti!

Spero che l’argomento sia stato interessante. Se avete domande, o notate errori usate i commenti!

Alla prossima!

Oltre al crossing over, che avviene nei gameti, abbiamo la ricombinazione somatica che avviene nei linfociti. (somatica perché avviene in cellule somatiche e non germinali). Il meccanismo di base è lo stesso, cambia ovviamente il soggetto e il risultato. (tra l’altro, sempre nel post Knock out, spiego come è possibile usando la ricombinazione ottenere delle mappe cromosomiche dei geni, se vi interessa.. mi faccio anche la pubblicità).
Prendiamo come esempio il BCR. Il BCR è un recettore che appartiene alla famiglia delle Immunoglobuline, ovvero degli anticorpi. Anzi, esso stesso è un anticorpo, e la sua funzione è la stessa, ma a differenza di un anticorpo non viene liberato all’esterno, ma rimane fissato alla membrana cellulare. Quindi alla fine, gli anticorpi vengono sintetizzati a partire dagli stessi geni utilizzati per il recettore.
Per spiegare l’organizzazione dei geni del BCR, indispensabile per capire la ricombinazione somatica, faccio il percorso inverso, parto dalla proteina e arrivo al gene.
Come è fatto un BCR, e quindi un anticorpo? Sono delle proteine multimeriche, formate da più subunità proteiche, ciascuna codificata dal proprio gene. In particolare, sono costituiti da due catene proteiche pesanti, identiche tra loro associate. Ciascuna catena proteica pesante è a sua volta associata con una catena più leggera. In totale due catene pesanti, identiche, e due catene leggere, identiche. Sia le catene pesanti che quelle leggere sono divisibili in due sottoregioni, una variabile, ed una costante. L’associazione delle regioni variabili delle catene pesanti con quelle leggere formano la tasca di legame con l’antigene. Ciascun anticorpo avrà quindi due siti di legame identici per l’antigene perchè ci sono due coppie di catene pesanti e leggere. Per farvi un’idea potete dare un’occhiata a questo Link , che vi mostra, oltre alla struttura quaternaria della proteina (la prima immagine), anche uno schema più comprenibile della struttura dell’anticorpo.
Gli anticorpi possono inoltre essere di classi diverse (le classi si chiamano isotipi), ciascun isotipo si differenzia dall’altro per la porzione costante delle catene pesanti. Pertanto esistono gli anticorpi di classe A, D, E, G e M. Anche le catene leggere hanno due classi, K e λ. Tutto questo è molto mnemonico, ma necessario. Adesso arriva la parte divertente.
Esistono un gene che codifica per la catena K, uno per quella λ mentre tutte le catene pesanti sono codificate da un unico gene, o locus. Ciascuno di questi geni ha tre regioni, chiamate in ordine V, J e C. Il gene delle catene pesanti ha anche la regione D. Ciascuna regione, in ordine V, D, J e C contiene a sua volta delle sotto regioni, separate da DNA non codificante. Ad esempio il gene K leggo che ha circa 35 regioni V. Ciascun tratto V è diverso da tutti gli altri. Le regioni V(D) e J vanno a costituire la regione variabili delle catene, mentre la regione C quella costante.
La ricombinazione somatica cosa fa? Attraverso due enzimi RAG1 e RAG2 i cui geni vengono espressi solo durante la maturazione linfocitaria, vengono congiunte casualmente una regione V, una regione D ed una regione J, eliminando le sequenze interposte. Viene a crearsi una regione VDJ (o VJ per le catene leggere), che è praticamente unica nel suo genere, perché ottenuta mediante l’unione casuale dei segmenti genici V, D e J. Ci sono delle sequenze di riconoscimento per evitare che si giustappongano sequenze sbagliate. Inoltre la ricombinazione avviene soltanto su uno dei due alleli per ogni gene, in modo da evitare la sintesi di due recettori diversi. E se, ad esempio, viene ricombinato il gene λ, il gene K viene represso per evitare la sintesi di due catene leggere diverse.
Mentre per le catene leggere il discorso finisce qua, per le catene pesanti c’è ancora il discorso dell’isotipo. Il segmento genico unito VDJ viene trascritto dalla RNA polimerasi II in un RNA messaggero fino alle regioni C più prossimali. Abbiamo detto che la regione costante determina l’isotipo. Le regioni ci più prossimali sono quella M e quella D, quindi il primo isotipo che viene sintetizzato è di classe M o di classe D. entrambi gli isotipi possono venire espressi da una stessa cellula Avremo quindi una proteina formata da due catene pesanti identiche ricombinate, e da due catene leggere ricombinate anch’esse, o K o λ.
Tutti i Linfociti B, all’inizio, esprimono recettori di classe M e/o D sulla loro membrana. Quando una cellula B matura incontra per la prima volta il suo antigene specifico si attiva, e lo scopo dell’attivazione è quello di produrre anticorpi, che come ho detto, sono identici al BCR, solo che non sono inseriti nella membrana cellulare ma vengono rilasciati all’esterno. Durante l’attivazione il clone B va incontro a divisioni cellulari che porteranno alla formazione di due tipi di cellule: i cloni memoria e le plasmacellule. I primi rimangono silenti nell’organismo fino ad un successivo contatto con l’antigene, nel qual caso si riattivano e iniziano una nuova risposta immunitaria; le seconde hanno una vita limitata durante la quale producono grandi quantità di anticorpi. Durante l’attivazione è possibile che le plasmacellule vadano incontro allo scambio dell’isotipo della catena pesante, ovvero, attraverso un secondo evento di ricombinazione che porta alla congiunzione del segmento VDJ già ricombinato con un segmento C diverso da M o da D (A, E o G), eliminando tutto il segmento di DNA tra VDJ e il segmento C prescelto. Per cui, avremo una catena pesante che ha la stessa specificità per l’antigene, ma un diverso isotipo e quindi diverse proprietà. Una volta effettuato lo scambio dell’isotipo, quella plasmacellula non potrà più cambiarlo, e continuerà a sintetizzare anticorpi di quell’isotipo. Siccome le plasmacellule saranno molte, ci saranno scambi di isotipi diversi, e quindi avremo contro uno stesso antigene anticorpi con isotipi diversi.
Un discorso Analogo, anche se leggermente diverso vale per il recettore dei Linfociti T. Riassumo quindi i diversi processi che portano alla diversificazione dei BCR, e in modo analogo dei TCR:
1) Diversità combinatoria: La ricombinazione di n segmenti V, m segmenti D e x segmenti J in modo del tutto casuale.
2) Giustapposizione di un qualsiasi VDJ della catena pesante ed un qualsiasi VJ di una catena leggera
3) Non paghi di questo, durante la ricombinazione possiamo avere a livello delle giunzioni tra segmento V e il segmento D, e tra quest’ultimo e il segmento J l’aggiunta o la perdita casuale di alcuni nucleotidi. Cosicché se anche due BCR avessero lo stesso segmento VDJ non sarebbero comunque uguali.

La sintesi del BCR e del TCR è un processo centrale della maturazione linfocitaria. Se un clone non dovesse riuscire ad esprimere il suo recettore andrebbe incontro all’ Apoptosi. Inoltre, poichè le combinazioni sono casuali, possono uscire fuori delle combinazioni difettose, nel qual caso la cellula verrebbe comunque destinata all’apoptosi così come se il recettore risultasse specifico ad un antigene del self, in modo da evitare che il sistema immunitario si attivi contro l’organismo stesso (Tolleranza).

So che è stato un post lungo, difficile e magari anche noioso, ma spero di essere riuscito a trasmettere l’incredibile raffinatezza e complicatezza del processo. Se avete domande o se notate errori usate i commenti!

Alla prossima!

Con questo è tutto, alla prossima.

In questo modo la cellula “sente e risponde” ai segnali provenienti dell’esterno e si adatta. Fenomenale, no?
Ma ritorniamo al complesso Ligando-Recettore. Voglio pararvi un po’ più a fondo di questa fortunata coppia.
Prendiamo Il classico modello di recettore, quello esposto in membrana. E’ una proteina, che può essere multimerica (ovvero composta da diverse subunità) o monomerica ma non è detto. Ha almeno un sito di legame per il suo ligando specifico, ma può avere anche altri siti di legame per cosiddetti modulatori allosterici, ovvero molecole che si legano in siti diversi da quello del ligando (quindi non competono con esso, dopo vediamo cosa significa competere) ma influenzano comunque l’attività del recettore.
Molto spesso esiste una relazione tra concentrazione del ligando ed effetto (dove per effetto si intende una variazione funzionale rispetto all’assenza di ligando). Questa relazione in molti casi può essere spiegata dall’equazione:

Dove E è l’effetto, Emax è l’effetto massimo ottenibile, [L] è la concentrazione di ligando e Kd è la concentrazione di ligando alla quale si ha E=50% (per i più esperti è l’equivalente della costante di Michaelis-Menten nella cinetica enzimatica, ma la stessa equazione è equivalente a quella usata per determinare la velocità degli enzimi).
Se proviamo a mettere sugli assi cartesiani la curva ottenuta da quest’equazione mettendo nelle ascisse il log[L] e nelle ordinate E otteniamo una curva come la seguente:

All’inizio, anche con variazioni alte di [L] si ha uno scarso aumento di E, poi per piccoli aumenti di [L] si ha un esponenziale aumento di E, infine si ritorna in una situazione simile a quella di partenza. Emax è l’effetto ottenuto con tutti i siti del recettore saturati. Per cui non importa se aggiungiamo altro ligando, l’effetto non aumenta.
Vi starete domandando perché ci sono tre curve. Questo sarà chiaro ora. Se oltre al nostro ligando proviamo ad aggiungere concentrazioni crescenti di una molecola che, pur legandosi al recettore nello stesso sito di legame del ligando, non lo attiva (lo chiamiamo antagonista) otteniamo, per concentrazioni maggiori di antagonista, uno shift verso destra della curva concentrazione/effetto; La spiegazione è che essendo l’antagonista un competitore del nostro ligando (compete con esso per legarsi nello stesso sito di legame) ci vorranno concentrazioni maggiori di ligando per ottenere lo stesso effetto. Aumenta quindi sia [L] sia la K_D, ma non si hanno variazioni dell’E_max, che rimane sempre 100.

Ci sarebbero tante altre considerazioni da fare (ad esempio cosa succede alla curva in caso di un antagonista non competitivo, in questo caso otteniamo sempre uno shift verso destra della curva, ma otteniamo un abbassamento dell’Emax), ma credo di aver già messo tanta carne al fuoco.
Come sempre, se avete domande, se ci sono errori, se siete curiosi e volete approfondire un argomento, scrivete nei commenti!!

Un ringraziamento va ad Alice per il grafico :)

Nel post precedente ho accennato a come la definizione che noi abbiamo di gene sia stata più volte modificata e rivoluzionata nel tempo. Volevo dedicare questo articolo alla storia del gene, alla sua scoperta e all’evoluzione del concetto che noi abbiamo di esso fino ai nostri giorni.
Nel 2003, il National Human Genome Research Institute ha iniziato un progetto volto a definire ed identificare ogni elemento funzionale presente nel nostro genoma. I risultati sono stati pubblicati su Nature in un articolo di 18 pagine dal titolo “Identification and analysis of functional elements in 1% of the Human Genome by the ENCODE pilot project”.
Ma prima, volevo tornare indietro nel tempo. Fino a quando? Fino alla seconda metà dell’800, quando due grandi lavori, indipendenti l’uno dall’altro, ipotizzarono l’esistenza di fattori che determinavano i caratteri di un individuo (oggi diremmo il fenotipo) e che questi erano ereditabili di generazione in generazione con delle modalità in parte prevedibili. Questi fattori erano discreti. Ovviamente sto parlando dei lavori di Mendel prima e Darwin poi. Questi lavori sono stati fatti con un’ottica completamente diversa: il lavoro di Mendel era un lavoro da genetista, quello di Darwin è ovviamente un lavoro sull’evoluzione. Non si sapeva ancora nulla sulla natura di questi fattori, e nulla si sarebbe saputo per molti anni ancora.
Sempre in questa metà di secolo, attorno al 1880 un biologo tedesco, Walther Flemming, scoprì i cromosomi (corpi colorati) come entità che si trasmettevano dalla cellula madre alle cellule figlie in egual numero. Sempre in questi anni vennero effettuati anche studi sulla fecondazione e sulla meiosi.
Ma ancora nulla si sapeva delle unità ereditabili, né si sapeva dove fossero né di cosa fossero costituite. Nel 1903 il biologo americano Walter Sutton ipotizzò che fossero i cromosomi i portatori fisici delle unità ereditarie e che questi caratteri ereditari esistono in coppie, così come in coppie esistono i cromosomi.
Pochi anni dopo il grande genetista americano Morgan spiegò il fenomeno della ricombinazione genetica e spiegò in questo modo i meccanismi dell’ereditarietà. Non solo, in base alla frequenza di ricombinazione riuscì anche a disegnare una mappa genetica, fissando in questo modo all’interno dei cromosomi i geni. Fino allora i geni, iniziavano già a chiamarsi così, erano stati piuttosto astratti, nessuno ne aveva mai visto uno, si sapeva che esistevano ma nulla di più. Morgan diede loro una posizione specifica e misurò anche le distanze tra un gene e l’altro (di questo ho parlato nell’articolo “Knock out”, nella parte scritta in corsivo; se vi interessa potete andarvela a leggere). Questa posizione venne chiamata Locus. I geni quindi esistevano, erano localizzati sui cromosomi in posizione fisse e venivano ereditati da una generazione all’altra. Ma ancora molto doveva essere scoperto. Tanto per cominciare erano davvero i geni a trasportare l’informazione? Sembrava di sì, ma mancava la prova fondamentale. Come erano organizzati questi geni? Qual’era la loro natura?
Quando si andò ad analizzare la natura dei cromosomi si scoprì che erano costituiti da due componenti, una chiamata nucleina e l’altra erano le proteine. La composizione della nucleina era innanzitutto di natura acida, e poi aveva una struttura decisamente molto più semplice rispetto alle proteine. Da qui nacque una disputa durata diversi decenni che vedeva contrapposti chi credeva che fosse la nucleina la responsabile della trasmissione ereditaria dei caratteri e chi invece le proteine. Questa disputa finì nel 1944 quando l’americano Avery, in uno degli esperimenti più importanti della biologia molecolare, dimostrò che era la nucleina la sostanza portatrice dell’informazione, in quanto, se estratta da batteri patogeni, era la sola in grado di “trasformare” dei batteri non patogeni in patogeni, anche a bassissime concentrazioni. Stranamente i risultati di Avery non destarono lo scalpore che ci si sarebbe atteso.
Sempre negli anni quaranta del secolo scorso nacque la famosa idea che ciascun gene dia origine ad uno specifico enzima.
Infine, negli anni 50 venne finalmente scoperta la struttura molecolare della nucleina, o DNA, da esperimenti sulla diffrazione di raggi X dagli arcinoti Watson e Crick.
Ora si avevano in mano importanti informazioni: I geni sono delle unità discrete costituite di DNA e localizzate in posizioni fisse sui cromosomi. Sono i responsabili della trasmissione ereditaria dei caratteri e ciascuno di loro contiene l’informazione per costruire una proteina.
Si iniziò a studiare il codice genetico, come cioè dal linguaggio dei quattro nucleotidi A, T, C e G si potesse arrivare al linguaggio delle proteine, costituite di amminoacidi. Si scoprì inoltre che tra il DNA e la proteina c’era un intermediario, l’RNA messaggero. Sono gli anni 60, gli anni del dogma centrale della biologia molecolare che enunciava che l’informazione passava dal DNA, all’RNA e quindi alle proteine. Attraverso un sistema di codifica ben determinato. Questo dogma ebbe vita breve con la scoperta dei retrovirus.
La definizione “un gene una proteina” però iniziava ad andare stretta già in quegli anni, perchè alcuni geni davano origine a degli RNA che però non venivano tradotti in proteine, ma davano origine ai ribosomi e agli RNA transfer.
Negli anni settanta si iniziò a scoprire come i geni erano organizzati e come venivano espressi e letti. Si iniziò quindi a definire gene una sequenza funzionale compresa tra un codone di inizio ed uno di fine. Una cosiddetta ORF, una open reading frame. Il concetto di open reading frame si basa sul fatto che i geni vengono letti a gruppi di tre nucleotidi, o codoni, ciascuno dei quali codifica per un amminoacido. Perciò una sequenza:

CATGCCAATTAGCTAA

Può essere letta: CAT-GCC-AAT-TAG-CTA-A… oppure ..C-ATG-CCA-ATT-AGC-TAA , oppure ancora: ..CA-TGC-CAA-TTA-GCT-AA.. Ci si ferma qua perchè slittando di un altro nucleotide ancora si finisce nel primo caso.
Siccome la seconda lettura possiede un ATG e un TAA che sono rispettivamente il codone di inizio e uno dei codoni di fine, molto probabilmente è la lettura giusta. Da notare che non ci sono solo questi tre modi per leggere una sequenza, ma ci sono anche i rispettivi per leggere la sequenza complementare. Per questo si dice che una sequenza si può leggere in sei modi diversi.
Contemporaneamente si sviluppavano degli algoritmi per predire se una sequenza potesse essere o meno una ORF. L’inizio della bioinformatica.
La definizione di gene dovette essere ancora cambiata in seguito alla scoperta degli esoni e degli introni e dello splicing alternativo (leggersi l’inizio dell’articolo precedente). La ORF non era più continua, ma interrotta dagli introni e inoltre poteva dare origine a proteine diverse. Diciamo che si potrebbe dire un gene molte proteine. Ma comunque sarebbe scorretto, perchè per proteina si intende un prodotto funzionale, mentre spesso i geni codificano per delle subunità di una proteina, che da sole non hanno alcuna funzione. Quindi si potrebbe correggere con un gene (o ORF) codifica una serie di prodotti funzionali, proteine o RNA. Una definzione di gene che tenga conto di questa realtà è “un locus di esoni cotrascritti”
Veniamo ai giorni nostri. Attualmente si tende a definire un gene in base alla sua sequenza. una definizione potrebbe essere, in lingua originale  “a locatable region of genomic sequence, corresponding to a unit of inheritance, which is associated with regulatory regions, transcribed regions and/or other functional sequence regions” Traducibile con “una regione localizzabile della sequenza genomica, corrispondente ad un’unità ereditaria che è associata a regioni regolatrici, a regioni trascrivibili e/o altre sequenze funzionali” (Pearson 2006).
Con questa definizione tuttavia si hanno dei problemi. Infatti, sebbene nessuna definizione prima d’ora enunciata parlasse delle sequenze regolatrici, includerle nella definizione potrebbe essere problematico, visto che molte sequenze regolatrici sono estremamente distanti dalla regione codificante. In questo modo si avrebbe un’idea di gene “diluita” nel genoma e non compatta in un singolo locus.
Un altro problema che si fa avanti è la scoperta che in moltissimi casi i geni sono sovrapposti, dividono cioè la stessa sequenza di DNA, ma posseggono diverse reading frame.  Sono geni letti in maniera sfalsata, quindi.
Come vedete, non esiste una definizione di Gene che sia completamente senza problemi.
Ma veniamo, finalmente, al famoso ENCODE project, di cui parlavao all’inizio. Siamo finalmente arrivati alle ultime battute. Questo progetto aveva lo scopo di definire ed identificare ogni elemento funzionale presente nel nostro genoma. Cosa hanno ottenuto?
Innanzitutto, se per funzionale si intende che viene trascritto, una grande quantità di trascritti provenienti da regioni non identificate prima come geni è stata rivelata. Di questo problema mi sono occupato diffusamente nell’articolo “Dark Matter”, materia oscura, perchè di questo si tratta. Trascritti di cui non riusciamo a dare una spiegazione funzionale.
Inoltre, in contrasto con la definizione di gene come unità fisica definita nello spazio e separata dagli altri tende a cadere sia in base alla scoperta dei geni sovrapposti, sia perchè in questo modo si formano delle ampie regioni genomiche in cui sono raggruppati molti geni sovrapposti senza possibilità di definire una regione genica ed intergenica con sicurezza.
Insomma, sembra quasi che, ad un secolo e mezzo di distanza la definizione di Gene non possa più rispondere ai recenti (più o meno) sviluppi delle biologia molecolare. I ricercatori del ENCODE-project hanno provato a scendere a compromessi e hanno provato a definire un gene così:

“The gene is a union of genomic sequences encoding a coherent
set of potentially overlapping functional products.”

Il gene è un unione di sequenze genomiche codificanti un set coerente di prodotti funzionali potenzialmente sovrapposti.
Sembra una definizione abbastanza semplice, tuttosommato. Io mi aspettavo qualcosa di più complesso, ma sembra funzionare lo stesso. è Semplice, concisa e lineare. A volte le cose semplici sono le più corrette.
Vediamo se funziona:
-in caso di geni continui, la definizione si riduce alla classica definizione di gene che sappiamo: una sequenza di DNA che codifica per un prodotto funzionale, RNA o proteina.
-Per i geni discontinui e/o sovrapposti funziona, perchè è considerato come unione di sequenze codificanti che possono anche essere sovrapposte.
-Anche lo splicing alternativo sembra essere spiegato, in quanto parla di prodotti finali, quindi possono essere anche molteplici.
-Le regioni regolatrici non sono incluse nella definizione. Qui secondo me è stata una scelta. Se fossero state incluse però, avrebbero complicato ulteriormente la questione.

Riconosco che è una questione davvero complicata. Alcune cose non sono chiare nemmeno a me. Comunque la mia intenzione era quella di darvi un’idea di come le cose siano andate complicandosi sempre di più. Ma credo sia proprio questo il bello! alla prossima.

Per scrivere questo articolo mi sono basato in parte sul seguente articolo: “Mark B. Gerstein, Can Bruce, Joel S. Rozowsky, et al., What is a gene, post-ENCODE? History and updated definition, Genome Res, 2007 17: 669-681″

Uno degli annosi dilemmi della biologia molecolare, molti anni fa, era la correlazione tra complessità dell’organismo e dimensioni del genoma. Un organismo complesso, si pensava, doveva possedere un altissimo numero di geni, mentre un organismo meno complesso poteva accontentarsi di un numero di geni più modesto. Ovviamente, da bravi presuntuosi quali siamo, l’essere umano doveva averne, come minimo, un centinaio di migliaia. Non di meno.
La stima che venne eseguita, però, parlava di ben altre cifre: circa 25-30’000 geni. Se poi si andavano a guardare altri esseri viventi si scopriva che il moscerino della frutta ne possiede circa 15 mila e un vermiciattolo (il nematode C. elegans) circa 20 mila. Brutta storia. E’ chiaro che non si può tentare di spiegare la complessità con dei semplici numeri o con delle mere classifiche.
Alla fine degli anni settanta venne inoltre confutata la definizione di gene classica che la maggior parte di noi conosce “Un gene = Una proteina” con la scoperta dello splicing alternativo.
La scoperta dello splicing alternativo poteva essere una spiegazione alternativa alla complessità degli organismi. Cos’è lo splicing alternativo? E ancora prima, cos’è lo splicing?
La scoperta dei geni interrotti, negli eucarioti, è stato il primo passo per comprendere lo splicing. I geni degli eucarioti non sono costituiti da una sequenza codificante lineare e ininterrotta, dal codone di inizio a quello di stop. Sono costituiti da pezzi codificanti interrotti da pezzi non codificanti. I primi pezzi vengono chiamati esoni, i secondi introni. Quando il gene viene trascritto, viene trascritto tutto quanto esoni più introni. In media, nell’uomo, ogni gene è costituito da 9 esoni e 8 introni. Ma è soltanto una media. Il gene ErbB4, nell’uomo, ha 28 esoni, e non è neanche quello che ne ha di più.
Il trascritto così formato non può essere subito tradotto in proteina, per ovvi motivi: i ribosomi hanno bisogno di leggere una ORF (open reading frame, nota come cornice di lettura) continua, non saltellante. Per questo l’RNA messaggero appena formato viene subito processato. Il processamento o processing avviene sempre nel nucleo e consta di tre fasi: il Capping, la Poliadenilazione e lo Splicing.
Il capping consiste nell’aggiunta all’inizio dell’RNA (al 5′) di una 7-metil guanosina, ma non attraverso il solito legame 3′-5′, ma con l’insolito 5′-5′. Questo cap ha il compito di proteggere l’RNA dalla degradazione e di regolare il trasporto dello stesso fuori dal nucleo per la traduzione.Funzione simile ha la poliadenilazione, ovvero l’aggiunta di qualche centinaio di residui di adenosina alla fine del trascritto (3′).
Veniamo allo splicing. Questo processo consiste nel staccare selettivamente gli introni e unire conseguentemente gli esoni, formando così il trascritto maturo che potrà essere tradotto.

Il meccanismo dello splicing è estremamente complesso e non starò a parlarne, perché credo che per chi non studi espressamente biologia molecolare non sia interessante (se però, nonostante questi avvertimenti, vorrete saperne di più chiedete pure!). Quello che mi limiterò a dire è che possono esistere due forme di splicing, uno per così dire autonomo, ovvero che non necessita elementi esterni, ed uno guidato da un complesso macchinario formato da proteine ma soprattutto da RNA stesso, ovviamente non codificante. E’ questo uno dei casi in cui è l’RNA non le proteine ad avere un ruolo da catalizzatore. L’altro caso è ovviamente il ribosoma. Il ribosoma e lo spliceosoma (ovvero il macchinario che catalizza lo splicing, sì lo so che è una parola orribile) possono essere delle vestigia del cosiddetto RNA world, precedente alla comparsa del DNA.
La domanda che vi potete essere posti è: come si riesce a distinguere un esone da un introne, e soprattutto come si riesce ad individuare correttamente la fine di un esone e l’inizio di un introne. Non è così semplice. Innanzitutto, studi comparativi (ovvero che prendevano in esame un gran numero di sequenze) hanno tracciato dei profili più o meno conservati di giunzione esone-introne. Ovvero di quella manciata di nucleotidi a cavallo tra la fine di un esone e l’inizio di un introne e viceversa.

La figura evidenzia un sito di splicing al 5′ e un altro al 3′ dell’introne, entrambi sono fondamentali per il distacco dell’introne e la congiunzione degli esoni.
Vi potrete chiedere se questa sequenza sia fissa ed immutabile per tutti i geni. Il diagramma che vi metterò ora vi darà la risposta:

Come si interpreta? Le dimensioni delle lettere sono proporzionali alla loro frequenza, quindi, ad esempio, nella posizione 7 dell’introne (il settimo nucleotide dall’inizio dell’introne) tutti i nucleotidi sono equivalenti, questo ci fa presupporre che non sia una posizione utile allo splicing, mentre nella posizione -1, 1 e 2 abbiamo quasi esclusivamente GGT. Questi devono essere i nucleotidi più importanti perché più conservati. Seguiti dalla A in -2 e in 3 e 4 e dalla G in 5. Sembra strano che così pochi nucleotidi bastino a garantire la specificità richiesta.
Abbiamo altre sequenze però, come il tratto di polipirimidine (py tract) e il punto di ramificazione. Numerose malattie genetiche e tumori sono dovuti a difetti nello splicing, si stima che siano circa il 15%.Ma veniamo ora allo splicing alternativo. E’ questo un fenomeno molto interessante e consiste nella possibilità per un gran numero di geni di dare origine a diversi prodotti, o isoforme, alcune correlate funzionalmente tra loro, altre invece completamente diverse. Lo splicing alternativo non è un eccezione, è la regola. Si stima che più del 70% dei geni nell’uomo vada incontro a questo fenomeno (ci sono stime diverse, ovviamente in base alle tecniche utilizzate per ottenerle). Come è possibile arrivare a questo? Il modo più comune, forse, è quello di eliminare uno o più esoni dal trascritto primario, generando così un’isoforma più corta; oppure trattenendo un introne tra due esoni, anziché eliminarlo; o anche, grazie alla presenza di siti di splicing alternativi, la formazione di esoni/introni di diversa lunghezza. Normalmente distinguiamo esoni e introni costitutivi e sono esoni e introni sempre presenti/assenti nel trascritto maturo. Esistono poi i cosiddetti esoni/introni opzionali che possono o meno venire inclusi. Inoltre ci sono dei casi in cui la presenza nel trascritto maturo di un esone implica necessariamente l’assenza di un altro esone, in questo caso parliamo di esoni mutualmente esclusivi. Questo ovviamente può generare una varietà enorme di trascritti. Ci sono geni anche con decine di varianti diverse, ciascuna delle quali darà origine a proteine diverse. Quindi non solo il concetto del gene è stravolto (e venne stravolto molte volte ancora, per gli interessati ho da consigliare un ottimo articolo sull’evoluzione del concetto di gene negli anni) ma anche si riuscì a capire come da un numero relativamente modesto di geni si generasse una varietà così grande di proteine. La domanda da farsi ora è: cosa decide se un esone/introne debba essere incluso o meno? E’ un discorso estremamente complesso che vede in gioco un numero molto alto di fattori. Cercherò di semplificarlo al meglio.
Ci sono all’interno degli esoni e degli introni delle sequenze, anche molto lunghe, che vengono distinte in due classi: gli splicing-enhancers (SE) e gli splicing-silencers (SS). Queste sequenze giocano un ruolo fondamentale. Vengono riconosciute da numerose proteine (delle RBPs, RNA-binding-proteins) le quali possono influenzare lo splicing. In che modo? Vediamolo.
Le sequenze SE possono essere introniche od esoniche; a queste sequenze si legano delle proteine appartenenti alla famiglia SR (serin-rich, ricche di serina, un amminoacido), a loro volta queste proteine reclutano sul trascritto immaturo i componenti dello spliceosoma (il macchinario che catalizza lo splicing). Lo spliceosoma riconosce i siti di splicing 5′ e 3′ (vedere la figura due), in questo modo lo splicing può avvenire attraverso l’eliminazione dell’introne e la congiunzione degli esoni, secondo lo schema classico. Se in un trascritto immaturo funzionassero soltanto le sequenze SE, per forza di cose tutti gli esoni sarebbero tenuti e tutti gli introni eliminati.
Per far sì che ci possa essere lo splicing alternativo, ci sono anche le SS. Queste sequenze legano alte proteine, le quali coprono fisicamente sia le SE sia i siti di splicing 5′ e 3′ , in questo modo lo spliceosoma non può legarsi. Questo cosa comporta? Semplicemente che l’esone nel quale le SS sono attive, non verrà riconosciuto dallo spliceosoma, il quale si legherà alle sequenze di splicing più vicine a monte e a valle dell’esone; la regione compresa tra queste due sequenze, quindi con l’esone compreso verrà trattata come se fosse un introne e verrà eliminato dal trascritto.
Il tutto si gioca sull’equilibrio tra SS e SE e sulle proteine che legano queste sequenze. In base alla prevalenza di una famiglia di proteine sull’altra si avrà la ritenzione o l’eliminazione dell’esone. In questo quadro, potrebbe essere influente anche la velocità alla quale il trascritto viene sintetizzato dall’RNA polimerasi, perchè in questo modo alcune sequenze potranno essere disponibili con tempi diversi e potranno competere tra di loro.

Da quanto detto se ne deduce che:

*Un esone può venire incluso o escluso dal trascritto maturo in base all’equilibrio SE-SS.
*Due esoni mutualmente esclusivi saranno regolati in base alle competizione tra le loro sequenze e i loro siti di splicing. Supponiamo di avere un esone A e un esone B, ciscuno con le sue SE e SS. Nel caso degli esoni mutualmente esclusivi, le sequenze dell’uno “influenzano” il destino dell’altro. Per cui, ad esempio, se l’esone A riesce a legare più proteine di B sulle sue ES, esclude l’esone B, e viceversa. Ovviamente prendete con le pinze il “riesce”, non è una gara, è soltanto una questione di equilibrio.
Lo splicing alternativo è, come dicevo, molto diffuso. Una cosa che è importante sapere è che è anche tessuto-specifico. Questo significa che tessuti diversi esprimono isoforme diverse dello stesso gene attraverso splicing alternativi.  Infatti l’analisi dello splicing in diversi tessuti permette di stabilirne l’origine. Come è possibile manatenere splicing diversi in tessuti diversi? Molto spesso è dovuto all’espressione di fattori di splicjng diversi da tessuto a tessuto e questo determina eventi di splicing specifici. Il sistema nervoso è forse il tessuto che presenta il più alto grado di splicing alternativo tessuto specifico. Anche all’interno dello stesso sistema nervoso ci sono aree con diversi pattern di splicing.

Voglio concludere questo papiro con un esempio estremo di splicing alternativo. Questa volta non sarà l’essere umano ‘esempio, ma il nostro amico Drosophila.  Il moscerino, durante lo sviluppo del suo sistema nervoso esprime una proteina chiamata “Dscam”. Questa proteina, espressa sui neuroni in via di sviluppo, è un recettore appartenente alla famiglia CAM (cell-adhesion-molecules), è quindi una proteina che media l’adesione cellula-cellula. Il gene di questa proteina è forse il più complesso gene che si sia mai visto, avendo ben 38016 varianti di splicing, solo lui. Se la drosophila ha circa 15 mila geni, solo dscam ha più varianti che tutti i suoi geni messi assieme. Questo perchè il gene in questione ha tre esoni, il 4, il 6 e il 9 che hanno rispettivamente 12, 48 e 33 varianti mutualmente esclusive, quindi soltanto una variante per esone è mantenuta nel trascritto maturo. Non ho fatto il calcolo combinatoriale, per cui non so dirvi se vengono effettivamente 38 mila e passa varianti, ma confido che chi l’ha fatto l’abbia fatto giusto.  Spaventoso, vero? Non solo spaventoso, direi anche meraviglioso. Alla faccia di chi crede che solo l’uomo e i mammiferi sono degni di essere studiati. Ciascun neurone esprime una sola variante di splicing, e questo è necessario per mantenere l’identità neuronale stessa. Non credo che esistano due neuroni con la stessa isoforma Dscam. Non è ancora chiaro se la scelta venga fatta casualmente.

Spero di essere stato interessante, nonostante la lunghezza dell’articolo. come sempre se avete domande fatele! se desiderate saperne di più chiedete, posso consigliarvi numerosi articoli. Se notate errori, per favore, fatemelo sapere nei commenti. Alla prossima e Buone vacanze!

Spero di essere stato chiaro e non confusionario. spero di aver reso l’idea di quello che volevo dire! Se avete domande ovviamente siete caldissimamente invitate a farle. Così pure se volete semplicemente commentare o criticare!

Come sempre, spero di non avervi annoiato. Scrivete commenti e se avete qualsiasi osservazione o critica da fare, fatela!

Al prossimo post (chissà, magari varierò un po’ ..)

Il titolo di questo post è molto chiaro (o forse no?). Parliamo di materia oscura, ma non la materia oscura dell’universo.. di quella se ne occupano i fisici.. Ma parliamo della materia oscura del genoma. Interessante analogia. Questo, devo dirlo subito, non sarà un post in cui troverete spiegazioni, perchè spiegazioni al momento non ce ne sono, ma solo ipotesi. Questo post più che altro è fatto di domande.

Il genoma è una struttura molto complessa, il cui funzionamento non è del tutto chiaro. Direi anzi che sappiamo pochissimo su come funziona! Dai batteri fino a noi, il genoma ha subito un’evoluzione che l’ha portato, non solo ad ingrandirsi, ma anche ad incorporare sequenze dal significato per ora ignoto.

Qui trovate un elenco di alcuni organismi, dai lieviti fino a noi, ordinati secondo le dimensioni del genoma, espresse in megabasi Mb (1Mb= 10^6 basi).
Una tale differenza di dimesioni non è però linearmente proporzionale nè al numero di geni presenti, nè alla complessità dell’organismo.

E’ chiaro che c’è qualcosa che non va. Qualche calcolo che non torna.  Noi abbiamo circa 30 mila geni, un nematode 19000. un moscerino 13000. Per non parlare della densità genica. La densità genica del lievito è più di 40 volte la nostra.  Perchè questo? Perchè, come dicevo prima, il genoma nel corso dell’evoluzione ha acquisito moltissime sequenze non codificanti, dal significato ignoto, che fino a qualche anno fa veniva chiamato DNA spazzatura (Junk-DNA). Da cosa è composto questo DNA non codificante?

Sequenze regolatrici (promotori, enhancers), introni, sequenze altamente ripetute (satelliti, minisatelliti, microsatelliti), trasposoni (sequenze che si spostano all’interno del genoma), sequenze di origine virale e così via. Il tutto rende il DNA codificante appena l’1.5% di tutto il genoma!
Ci sono diverse teorie al riguardo. Secondo la teoria del gene egoista, questo sarebbe DNA parassita che sfrutta il DNA funzionante per propagarsi; secondo altri rappresenta un meccanismo di difesa: una mutazione ha molte più probabilità di generarsi in queste sequenze non codificanti, che nei geni.

Comunque si credeva che queste sequenze non solo non codificassero per proteine, ma che non venissero neppure trascritte. Del resto non aveva senso che fosse il contrario. La trascrizione è un meccanismo complessissimo, altamente regolato e soprattutto dispendioso dal punto di vista energetico. Non ha senso che vengano trascritte sequenze inutili.
Tuttavia, qualcosa ci deve essere sfuggito, perchè con le moderne tecniche di analisi del trascrittoma (tiling arrays, RNA-seq) si è scoperto proprio quello che non ci saremmo mai aspettati: molte sequenze di RNA si allineano perfettamente con sequenze genomiche non codificanti. Perchè mai, se è inutile, viene trascritto? Forse del tutto inutile non è. Forse abbiamo sbagliato noi, forse dovremmo evitare di chiamare inutile ogni cosa che non sappiamo cosa faccia.
E’ proprio questa la materia oscura a cui fa riferimento il titolo: sequenze di RNA trascritte non codificanti che aspettano ancora di essere classificate.
Ci sono delle ipotesi che tentano di inquadrare questo fenomeno, che ovviamente andranno verificate:

->Artefatti biologici: (per artefatto si intende comunemente errore) ovvero originano da una trascrizione non specifica e a bassa intensità del DNA, e siccome le il DNA non codificante è la maggior parte, la statistica la dice lunga.

->Geni non codificanti: Ci sono prove sperimentali che indicano che questa trascrizione inspiegata sia comunque in parte regolata, e questo suggerisce che i non-coding RNAs abbiano qualche funzione regolativa (del resto sono già noti alla comunità scientifica i micro-RNA e compagnia bella).

->Nuovi geni codificanti: Si ipotizza che ci possano essere dei geni ancora da scoprire e che questi vengano trascritti. Oppure possono essere degli pseudogeni che oramai hanno perso la loro funzione originaria.

Concludo con una nota. E’ normale che con le tecniche di analisi moderne e con il supporto della biologia computazionale le conoscenze che avevamo sul Genoma e sulla biologia in generale vangano stravolte. Semplicemente cambia il modo con cui vengono presi ed analizzati i dati e tutte le cose che prima davamo per certe ora vengono messe in discussione. In fondo tutti i dati che avevamo acquisito prima che le più moderne tecniche venissero messe a punto soffrivano di un grande difetto: il bias; tipico errore che si commette spesso quando si fanno esperimenti andando a cercare ciò che si vuole trovare, ignorando tutto il resto che magari non ci aspettiamo che ci sia e quindi non cerchiamo neppure. E’ normale che si trovassero solo trascritti di geni codificanti perchè non ci saremmo mai aspettati di trovare altro. Del resto le tecniche ancora non permettevano di fare altrimenti.

Se avete domande, suggerimenti, osservazioni critiche, insomma, se volete dire la vostra, non tiratevi indietro!