Nel post precedente ho accennato a come la definizione che noi abbiamo di gene sia stata più volte modificata e rivoluzionata nel tempo. Volevo dedicare questo articolo alla storia del gene, alla sua scoperta e all’evoluzione del concetto che noi abbiamo di esso fino ai nostri giorni.
Nel 2003, il National Human Genome Research Institute ha iniziato un progetto volto a definire ed identificare ogni elemento funzionale presente nel nostro genoma. I risultati sono stati pubblicati su Nature in un articolo di 18 pagine dal titolo “Identification and analysis of functional elements in 1% of the Human Genome by the ENCODE pilot project”.
Ma prima, volevo tornare indietro nel tempo. Fino a quando? Fino alla seconda metà dell’800, quando due grandi lavori, indipendenti l’uno dall’altro, ipotizzarono l’esistenza di fattori che determinavano i caratteri di un individuo (oggi diremmo il fenotipo) e che questi erano ereditabili di generazione in generazione con delle modalità in parte prevedibili. Questi fattori erano discreti. Ovviamente sto parlando dei lavori di Mendel prima e Darwin poi. Questi lavori sono stati fatti con un’ottica completamente diversa: il lavoro di Mendel era un lavoro da genetista, quello di Darwin è ovviamente un lavoro sull’evoluzione. Non si sapeva ancora nulla sulla natura di questi fattori, e nulla si sarebbe saputo per molti anni ancora.
Sempre in questa metà di secolo, attorno al 1880 un biologo tedesco, Walther Flemming, scoprì i cromosomi (corpi colorati) come entità che si trasmettevano dalla cellula madre alle cellule figlie in egual numero. Sempre in questi anni vennero effettuati anche studi sulla fecondazione e sulla meiosi.
Ma ancora nulla si sapeva delle unità ereditabili, né si sapeva dove fossero né di cosa fossero costituite. Nel 1903 il biologo americano Walter Sutton ipotizzò che fossero i cromosomi i portatori fisici delle unità ereditarie e che questi caratteri ereditari esistono in coppie, così come in coppie esistono i cromosomi.
Pochi anni dopo il grande genetista americano Morgan spiegò il fenomeno della ricombinazione genetica e spiegò in questo modo i meccanismi dell’ereditarietà. Non solo, in base alla frequenza di ricombinazione riuscì anche a disegnare una mappa genetica, fissando in questo modo all’interno dei cromosomi i geni. Fino allora i geni, iniziavano già a chiamarsi così, erano stati piuttosto astratti, nessuno ne aveva mai visto uno, si sapeva che esistevano ma nulla di più. Morgan diede loro una posizione specifica e misurò anche le distanze tra un gene e l’altro (di questo ho parlato nell’articolo “Knock out”, nella parte scritta in corsivo; se vi interessa potete andarvela a leggere). Questa posizione venne chiamata Locus. I geni quindi esistevano, erano localizzati sui cromosomi in posizione fisse e venivano ereditati da una generazione all’altra. Ma ancora molto doveva essere scoperto. Tanto per cominciare erano davvero i geni a trasportare l’informazione? Sembrava di sì, ma mancava la prova fondamentale. Come erano organizzati questi geni? Qual’era la loro natura?
Quando si andò ad analizzare la natura dei cromosomi si scoprì che erano costituiti da due componenti, una chiamata nucleina e l’altra erano le proteine. La composizione della nucleina era innanzitutto di natura acida, e poi aveva una struttura decisamente molto più semplice rispetto alle proteine. Da qui nacque una disputa durata diversi decenni che vedeva contrapposti chi credeva che fosse la nucleina la responsabile della trasmissione ereditaria dei caratteri e chi invece le proteine. Questa disputa finì nel 1944 quando l’americano Avery, in uno degli esperimenti più importanti della biologia molecolare, dimostrò che era la nucleina la sostanza portatrice dell’informazione, in quanto, se estratta da batteri patogeni, era la sola in grado di “trasformare” dei batteri non patogeni in patogeni, anche a bassissime concentrazioni. Stranamente i risultati di Avery non destarono lo scalpore che ci si sarebbe atteso.
Sempre negli anni quaranta del secolo scorso nacque la famosa idea che ciascun gene dia origine ad uno specifico enzima.
Infine, negli anni 50 venne finalmente scoperta la struttura molecolare della nucleina, o DNA, da esperimenti sulla diffrazione di raggi X dagli arcinoti Watson e Crick.
Ora si avevano in mano importanti informazioni: I geni sono delle unità discrete costituite di DNA e localizzate in posizioni fisse sui cromosomi. Sono i responsabili della trasmissione ereditaria dei caratteri e ciascuno di loro contiene l’informazione per costruire una proteina.
Si iniziò a studiare il codice genetico, come cioè dal linguaggio dei quattro nucleotidi A, T, C e G si potesse arrivare al linguaggio delle proteine, costituite di amminoacidi. Si scoprì inoltre che tra il DNA e la proteina c’era un intermediario, l’RNA messaggero. Sono gli anni 60, gli anni del dogma centrale della biologia molecolare che enunciava che l’informazione passava dal DNA, all’RNA e quindi alle proteine. Attraverso un sistema di codifica ben determinato. Questo dogma ebbe vita breve con la scoperta dei retrovirus.
La definizione “un gene una proteina” però iniziava ad andare stretta già in quegli anni, perchè alcuni geni davano origine a degli RNA che però non venivano tradotti in proteine, ma davano origine ai ribosomi e agli RNA transfer.
Negli anni settanta si iniziò a scoprire come i geni erano organizzati e come venivano espressi e letti. Si iniziò quindi a definire gene una sequenza funzionale compresa tra un codone di inizio ed uno di fine. Una cosiddetta ORF, una open reading frame. Il concetto di open reading frame si basa sul fatto che i geni vengono letti a gruppi di tre nucleotidi, o codoni, ciascuno dei quali codifica per un amminoacido. Perciò una sequenza:

CATGCCAATTAGCTAA

Può essere letta: CAT-GCC-AAT-TAG-CTA-A… oppure ..C-ATG-CCA-ATT-AGC-TAA , oppure ancora: ..CA-TGC-CAA-TTA-GCT-AA.. Ci si ferma qua perchè slittando di un altro nucleotide ancora si finisce nel primo caso.
Siccome la seconda lettura possiede un ATG e un TAA che sono rispettivamente il codone di inizio e uno dei codoni di fine, molto probabilmente è la lettura giusta. Da notare che non ci sono solo questi tre modi per leggere una sequenza, ma ci sono anche i rispettivi per leggere la sequenza complementare. Per questo si dice che una sequenza si può leggere in sei modi diversi.
Contemporaneamente si sviluppavano degli algoritmi per predire se una sequenza potesse essere o meno una ORF. L’inizio della bioinformatica.
La definizione di gene dovette essere ancora cambiata in seguito alla scoperta degli esoni e degli introni e dello splicing alternativo (leggersi l’inizio dell’articolo precedente). La ORF non era più continua, ma interrotta dagli introni e inoltre poteva dare origine a proteine diverse. Diciamo che si potrebbe dire un gene molte proteine. Ma comunque sarebbe scorretto, perchè per proteina si intende un prodotto funzionale, mentre spesso i geni codificano per delle subunità di una proteina, che da sole non hanno alcuna funzione. Quindi si potrebbe correggere con un gene (o ORF) codifica una serie di prodotti funzionali, proteine o RNA. Una definzione di gene che tenga conto di questa realtà è “un locus di esoni cotrascritti”
Veniamo ai giorni nostri. Attualmente si tende a definire un gene in base alla sua sequenza. una definizione potrebbe essere, in lingua originale  “a locatable region of genomic sequence, corresponding to a unit of inheritance, which is associated with regulatory regions, transcribed regions and/or other functional sequence regions” Traducibile con “una regione localizzabile della sequenza genomica, corrispondente ad un’unità ereditaria che è associata a regioni regolatrici, a regioni trascrivibili e/o altre sequenze funzionali” (Pearson 2006).
Con questa definizione tuttavia si hanno dei problemi. Infatti, sebbene nessuna definizione prima d’ora enunciata parlasse delle sequenze regolatrici, includerle nella definizione potrebbe essere problematico, visto che molte sequenze regolatrici sono estremamente distanti dalla regione codificante. In questo modo si avrebbe un’idea di gene “diluita” nel genoma e non compatta in un singolo locus.
Un altro problema che si fa avanti è la scoperta che in moltissimi casi i geni sono sovrapposti, dividono cioè la stessa sequenza di DNA, ma posseggono diverse reading frame.  Sono geni letti in maniera sfalsata, quindi.
Come vedete, non esiste una definizione di Gene che sia completamente senza problemi.
Ma veniamo, finalmente, al famoso ENCODE project, di cui parlavao all’inizio. Siamo finalmente arrivati alle ultime battute. Questo progetto aveva lo scopo di definire ed identificare ogni elemento funzionale presente nel nostro genoma. Cosa hanno ottenuto?
Innanzitutto, se per funzionale si intende che viene trascritto, una grande quantità di trascritti provenienti da regioni non identificate prima come geni è stata rivelata. Di questo problema mi sono occupato diffusamente nell’articolo “Dark Matter”, materia oscura, perchè di questo si tratta. Trascritti di cui non riusciamo a dare una spiegazione funzionale.
Inoltre, in contrasto con la definizione di gene come unità fisica definita nello spazio e separata dagli altri tende a cadere sia in base alla scoperta dei geni sovrapposti, sia perchè in questo modo si formano delle ampie regioni genomiche in cui sono raggruppati molti geni sovrapposti senza possibilità di definire una regione genica ed intergenica con sicurezza.
Insomma, sembra quasi che, ad un secolo e mezzo di distanza la definizione di Gene non possa più rispondere ai recenti (più o meno) sviluppi delle biologia molecolare. I ricercatori del ENCODE-project hanno provato a scendere a compromessi e hanno provato a definire un gene così:

“The gene is a union of genomic sequences encoding a coherent
set of potentially overlapping functional products.”

Il gene è un unione di sequenze genomiche codificanti un set coerente di prodotti funzionali potenzialmente sovrapposti.
Sembra una definizione abbastanza semplice, tuttosommato. Io mi aspettavo qualcosa di più complesso, ma sembra funzionare lo stesso. è Semplice, concisa e lineare. A volte le cose semplici sono le più corrette.
Vediamo se funziona:
-in caso di geni continui, la definizione si riduce alla classica definizione di gene che sappiamo: una sequenza di DNA che codifica per un prodotto funzionale, RNA o proteina.
-Per i geni discontinui e/o sovrapposti funziona, perchè è considerato come unione di sequenze codificanti che possono anche essere sovrapposte.
-Anche lo splicing alternativo sembra essere spiegato, in quanto parla di prodotti finali, quindi possono essere anche molteplici.
-Le regioni regolatrici non sono incluse nella definizione. Qui secondo me è stata una scelta. Se fossero state incluse però, avrebbero complicato ulteriormente la questione.

Riconosco che è una questione davvero complicata. Alcune cose non sono chiare nemmeno a me. Comunque la mia intenzione era quella di darvi un’idea di come le cose siano andate complicandosi sempre di più. Ma credo sia proprio questo il bello! alla prossima.

Per scrivere questo articolo mi sono basato in parte sul seguente articolo: “Mark B. Gerstein, Can Bruce, Joel S. Rozowsky, et al., What is a gene, post-ENCODE? History and updated definition, Genome Res, 2007 17: 669-681″

Uno degli annosi dilemmi della biologia molecolare, molti anni fa, era la correlazione tra complessità dell’organismo e dimensioni del genoma. Un organismo complesso, si pensava, doveva possedere un altissimo numero di geni, mentre un organismo meno complesso poteva accontentarsi di un numero di geni più modesto. Ovviamente, da bravi presuntuosi quali siamo, l’essere umano doveva averne, come minimo, un centinaio di migliaia. Non di meno.
La stima che venne eseguita, però, parlava di ben altre cifre: circa 25-30’000 geni. Se poi si andavano a guardare altri esseri viventi si scopriva che il moscerino della frutta ne possiede circa 15 mila e un vermiciattolo (il nematode C. elegans) circa 20 mila. Brutta storia. E’ chiaro che non si può tentare di spiegare la complessità con dei semplici numeri o con delle mere classifiche.
Alla fine degli anni settanta venne inoltre confutata la definizione di gene classica che la maggior parte di noi conosce “Un gene = Una proteina” con la scoperta dello splicing alternativo.
La scoperta dello splicing alternativo poteva essere una spiegazione alternativa alla complessità degli organismi. Cos’è lo splicing alternativo? E ancora prima, cos’è lo splicing?
La scoperta dei geni interrotti, negli eucarioti, è stato il primo passo per comprendere lo splicing. I geni degli eucarioti non sono costituiti da una sequenza codificante lineare e ininterrotta, dal codone di inizio a quello di stop. Sono costituiti da pezzi codificanti interrotti da pezzi non codificanti. I primi pezzi vengono chiamati esoni, i secondi introni. Quando il gene viene trascritto, viene trascritto tutto quanto esoni più introni. In media, nell’uomo, ogni gene è costituito da 9 esoni e 8 introni. Ma è soltanto una media. Il gene ErbB4, nell’uomo, ha 28 esoni, e non è neanche quello che ne ha di più.
Il trascritto così formato non può essere subito tradotto in proteina, per ovvi motivi: i ribosomi hanno bisogno di leggere una ORF (open reading frame, nota come cornice di lettura) continua, non saltellante. Per questo l’RNA messaggero appena formato viene subito processato. Il processamento o processing avviene sempre nel nucleo e consta di tre fasi: il Capping, la Poliadenilazione e lo Splicing.
Il capping consiste nell’aggiunta all’inizio dell’RNA (al 5′) di una 7-metil guanosina, ma non attraverso il solito legame 3′-5′, ma con l’insolito 5′-5′. Questo cap ha il compito di proteggere l’RNA dalla degradazione e di regolare il trasporto dello stesso fuori dal nucleo per la traduzione.Funzione simile ha la poliadenilazione, ovvero l’aggiunta di qualche centinaio di residui di adenosina alla fine del trascritto (3′).
Veniamo allo splicing. Questo processo consiste nel staccare selettivamente gli introni e unire conseguentemente gli esoni, formando così il trascritto maturo che potrà essere tradotto.

Il meccanismo dello splicing è estremamente complesso e non starò a parlarne, perché credo che per chi non studi espressamente biologia molecolare non sia interessante (se però, nonostante questi avvertimenti, vorrete saperne di più chiedete pure!). Quello che mi limiterò a dire è che possono esistere due forme di splicing, uno per così dire autonomo, ovvero che non necessita elementi esterni, ed uno guidato da un complesso macchinario formato da proteine ma soprattutto da RNA stesso, ovviamente non codificante. E’ questo uno dei casi in cui è l’RNA non le proteine ad avere un ruolo da catalizzatore. L’altro caso è ovviamente il ribosoma. Il ribosoma e lo spliceosoma (ovvero il macchinario che catalizza lo splicing, sì lo so che è una parola orribile) possono essere delle vestigia del cosiddetto RNA world, precedente alla comparsa del DNA.
La domanda che vi potete essere posti è: come si riesce a distinguere un esone da un introne, e soprattutto come si riesce ad individuare correttamente la fine di un esone e l’inizio di un introne. Non è così semplice. Innanzitutto, studi comparativi (ovvero che prendevano in esame un gran numero di sequenze) hanno tracciato dei profili più o meno conservati di giunzione esone-introne. Ovvero di quella manciata di nucleotidi a cavallo tra la fine di un esone e l’inizio di un introne e viceversa.

La figura evidenzia un sito di splicing al 5′ e un altro al 3′ dell’introne, entrambi sono fondamentali per il distacco dell’introne e la congiunzione degli esoni.
Vi potrete chiedere se questa sequenza sia fissa ed immutabile per tutti i geni. Il diagramma che vi metterò ora vi darà la risposta:

Come si interpreta? Le dimensioni delle lettere sono proporzionali alla loro frequenza, quindi, ad esempio, nella posizione 7 dell’introne (il settimo nucleotide dall’inizio dell’introne) tutti i nucleotidi sono equivalenti, questo ci fa presupporre che non sia una posizione utile allo splicing, mentre nella posizione -1, 1 e 2 abbiamo quasi esclusivamente GGT. Questi devono essere i nucleotidi più importanti perché più conservati. Seguiti dalla A in -2 e in 3 e 4 e dalla G in 5. Sembra strano che così pochi nucleotidi bastino a garantire la specificità richiesta.
Abbiamo altre sequenze però, come il tratto di polipirimidine (py tract) e il punto di ramificazione. Numerose malattie genetiche e tumori sono dovuti a difetti nello splicing, si stima che siano circa il 15%.Ma veniamo ora allo splicing alternativo. E’ questo un fenomeno molto interessante e consiste nella possibilità per un gran numero di geni di dare origine a diversi prodotti, o isoforme, alcune correlate funzionalmente tra loro, altre invece completamente diverse. Lo splicing alternativo non è un eccezione, è la regola. Si stima che più del 70% dei geni nell’uomo vada incontro a questo fenomeno (ci sono stime diverse, ovviamente in base alle tecniche utilizzate per ottenerle). Come è possibile arrivare a questo? Il modo più comune, forse, è quello di eliminare uno o più esoni dal trascritto primario, generando così un’isoforma più corta; oppure trattenendo un introne tra due esoni, anziché eliminarlo; o anche, grazie alla presenza di siti di splicing alternativi, la formazione di esoni/introni di diversa lunghezza. Normalmente distinguiamo esoni e introni costitutivi e sono esoni e introni sempre presenti/assenti nel trascritto maturo. Esistono poi i cosiddetti esoni/introni opzionali che possono o meno venire inclusi. Inoltre ci sono dei casi in cui la presenza nel trascritto maturo di un esone implica necessariamente l’assenza di un altro esone, in questo caso parliamo di esoni mutualmente esclusivi. Questo ovviamente può generare una varietà enorme di trascritti. Ci sono geni anche con decine di varianti diverse, ciascuna delle quali darà origine a proteine diverse. Quindi non solo il concetto del gene è stravolto (e venne stravolto molte volte ancora, per gli interessati ho da consigliare un ottimo articolo sull’evoluzione del concetto di gene negli anni) ma anche si riuscì a capire come da un numero relativamente modesto di geni si generasse una varietà così grande di proteine. La domanda da farsi ora è: cosa decide se un esone/introne debba essere incluso o meno? E’ un discorso estremamente complesso che vede in gioco un numero molto alto di fattori. Cercherò di semplificarlo al meglio.
Ci sono all’interno degli esoni e degli introni delle sequenze, anche molto lunghe, che vengono distinte in due classi: gli splicing-enhancers (SE) e gli splicing-silencers (SS). Queste sequenze giocano un ruolo fondamentale. Vengono riconosciute da numerose proteine (delle RBPs, RNA-binding-proteins) le quali possono influenzare lo splicing. In che modo? Vediamolo.
Le sequenze SE possono essere introniche od esoniche; a queste sequenze si legano delle proteine appartenenti alla famiglia SR (serin-rich, ricche di serina, un amminoacido), a loro volta queste proteine reclutano sul trascritto immaturo i componenti dello spliceosoma (il macchinario che catalizza lo splicing). Lo spliceosoma riconosce i siti di splicing 5′ e 3′ (vedere la figura due), in questo modo lo splicing può avvenire attraverso l’eliminazione dell’introne e la congiunzione degli esoni, secondo lo schema classico. Se in un trascritto immaturo funzionassero soltanto le sequenze SE, per forza di cose tutti gli esoni sarebbero tenuti e tutti gli introni eliminati.
Per far sì che ci possa essere lo splicing alternativo, ci sono anche le SS. Queste sequenze legano alte proteine, le quali coprono fisicamente sia le SE sia i siti di splicing 5′ e 3′ , in questo modo lo spliceosoma non può legarsi. Questo cosa comporta? Semplicemente che l’esone nel quale le SS sono attive, non verrà riconosciuto dallo spliceosoma, il quale si legherà alle sequenze di splicing più vicine a monte e a valle dell’esone; la regione compresa tra queste due sequenze, quindi con l’esone compreso verrà trattata come se fosse un introne e verrà eliminato dal trascritto.
Il tutto si gioca sull’equilibrio tra SS e SE e sulle proteine che legano queste sequenze. In base alla prevalenza di una famiglia di proteine sull’altra si avrà la ritenzione o l’eliminazione dell’esone. In questo quadro, potrebbe essere influente anche la velocità alla quale il trascritto viene sintetizzato dall’RNA polimerasi, perchè in questo modo alcune sequenze potranno essere disponibili con tempi diversi e potranno competere tra di loro.

Da quanto detto se ne deduce che:

*Un esone può venire incluso o escluso dal trascritto maturo in base all’equilibrio SE-SS.
*Due esoni mutualmente esclusivi saranno regolati in base alle competizione tra le loro sequenze e i loro siti di splicing. Supponiamo di avere un esone A e un esone B, ciscuno con le sue SE e SS. Nel caso degli esoni mutualmente esclusivi, le sequenze dell’uno “influenzano” il destino dell’altro. Per cui, ad esempio, se l’esone A riesce a legare più proteine di B sulle sue ES, esclude l’esone B, e viceversa. Ovviamente prendete con le pinze il “riesce”, non è una gara, è soltanto una questione di equilibrio.
Lo splicing alternativo è, come dicevo, molto diffuso. Una cosa che è importante sapere è che è anche tessuto-specifico. Questo significa che tessuti diversi esprimono isoforme diverse dello stesso gene attraverso splicing alternativi.  Infatti l’analisi dello splicing in diversi tessuti permette di stabilirne l’origine. Come è possibile manatenere splicing diversi in tessuti diversi? Molto spesso è dovuto all’espressione di fattori di splicjng diversi da tessuto a tessuto e questo determina eventi di splicing specifici. Il sistema nervoso è forse il tessuto che presenta il più alto grado di splicing alternativo tessuto specifico. Anche all’interno dello stesso sistema nervoso ci sono aree con diversi pattern di splicing.

Voglio concludere questo papiro con un esempio estremo di splicing alternativo. Questa volta non sarà l’essere umano ‘esempio, ma il nostro amico Drosophila.  Il moscerino, durante lo sviluppo del suo sistema nervoso esprime una proteina chiamata “Dscam”. Questa proteina, espressa sui neuroni in via di sviluppo, è un recettore appartenente alla famiglia CAM (cell-adhesion-molecules), è quindi una proteina che media l’adesione cellula-cellula. Il gene di questa proteina è forse il più complesso gene che si sia mai visto, avendo ben 38016 varianti di splicing, solo lui. Se la drosophila ha circa 15 mila geni, solo dscam ha più varianti che tutti i suoi geni messi assieme. Questo perchè il gene in questione ha tre esoni, il 4, il 6 e il 9 che hanno rispettivamente 12, 48 e 33 varianti mutualmente esclusive, quindi soltanto una variante per esone è mantenuta nel trascritto maturo. Non ho fatto il calcolo combinatoriale, per cui non so dirvi se vengono effettivamente 38 mila e passa varianti, ma confido che chi l’ha fatto l’abbia fatto giusto.  Spaventoso, vero? Non solo spaventoso, direi anche meraviglioso. Alla faccia di chi crede che solo l’uomo e i mammiferi sono degni di essere studiati. Ciascun neurone esprime una sola variante di splicing, e questo è necessario per mantenere l’identità neuronale stessa. Non credo che esistano due neuroni con la stessa isoforma Dscam. Non è ancora chiaro se la scelta venga fatta casualmente.

Spero di essere stato interessante, nonostante la lunghezza dell’articolo. come sempre se avete domande fatele! se desiderate saperne di più chiedete, posso consigliarvi numerosi articoli. Se notate errori, per favore, fatemelo sapere nei commenti. Alla prossima e Buone vacanze!

Spero di essere stato chiaro e non confusionario. spero di aver reso l’idea di quello che volevo dire! Se avete domande ovviamente siete caldissimamente invitate a farle. Così pure se volete semplicemente commentare o criticare!

Come sempre, spero di non avervi annoiato. Scrivete commenti e se avete qualsiasi osservazione o critica da fare, fatela!

Al prossimo post (chissà, magari varierò un po’ ..)

Il titolo di questo post è molto chiaro (o forse no?). Parliamo di materia oscura, ma non la materia oscura dell’universo.. di quella se ne occupano i fisici.. Ma parliamo della materia oscura del genoma. Interessante analogia. Questo, devo dirlo subito, non sarà un post in cui troverete spiegazioni, perchè spiegazioni al momento non ce ne sono, ma solo ipotesi. Questo post più che altro è fatto di domande.

Il genoma è una struttura molto complessa, il cui funzionamento non è del tutto chiaro. Direi anzi che sappiamo pochissimo su come funziona! Dai batteri fino a noi, il genoma ha subito un’evoluzione che l’ha portato, non solo ad ingrandirsi, ma anche ad incorporare sequenze dal significato per ora ignoto.

Qui trovate un elenco di alcuni organismi, dai lieviti fino a noi, ordinati secondo le dimensioni del genoma, espresse in megabasi Mb (1Mb= 10^6 basi).
Una tale differenza di dimesioni non è però linearmente proporzionale nè al numero di geni presenti, nè alla complessità dell’organismo.

E’ chiaro che c’è qualcosa che non va. Qualche calcolo che non torna.  Noi abbiamo circa 30 mila geni, un nematode 19000. un moscerino 13000. Per non parlare della densità genica. La densità genica del lievito è più di 40 volte la nostra.  Perchè questo? Perchè, come dicevo prima, il genoma nel corso dell’evoluzione ha acquisito moltissime sequenze non codificanti, dal significato ignoto, che fino a qualche anno fa veniva chiamato DNA spazzatura (Junk-DNA). Da cosa è composto questo DNA non codificante?

Sequenze regolatrici (promotori, enhancers), introni, sequenze altamente ripetute (satelliti, minisatelliti, microsatelliti), trasposoni (sequenze che si spostano all’interno del genoma), sequenze di origine virale e così via. Il tutto rende il DNA codificante appena l’1.5% di tutto il genoma!
Ci sono diverse teorie al riguardo. Secondo la teoria del gene egoista, questo sarebbe DNA parassita che sfrutta il DNA funzionante per propagarsi; secondo altri rappresenta un meccanismo di difesa: una mutazione ha molte più probabilità di generarsi in queste sequenze non codificanti, che nei geni.

Comunque si credeva che queste sequenze non solo non codificassero per proteine, ma che non venissero neppure trascritte. Del resto non aveva senso che fosse il contrario. La trascrizione è un meccanismo complessissimo, altamente regolato e soprattutto dispendioso dal punto di vista energetico. Non ha senso che vengano trascritte sequenze inutili.
Tuttavia, qualcosa ci deve essere sfuggito, perchè con le moderne tecniche di analisi del trascrittoma (tiling arrays, RNA-seq) si è scoperto proprio quello che non ci saremmo mai aspettati: molte sequenze di RNA si allineano perfettamente con sequenze genomiche non codificanti. Perchè mai, se è inutile, viene trascritto? Forse del tutto inutile non è. Forse abbiamo sbagliato noi, forse dovremmo evitare di chiamare inutile ogni cosa che non sappiamo cosa faccia.
E’ proprio questa la materia oscura a cui fa riferimento il titolo: sequenze di RNA trascritte non codificanti che aspettano ancora di essere classificate.
Ci sono delle ipotesi che tentano di inquadrare questo fenomeno, che ovviamente andranno verificate:

->Artefatti biologici: (per artefatto si intende comunemente errore) ovvero originano da una trascrizione non specifica e a bassa intensità del DNA, e siccome le il DNA non codificante è la maggior parte, la statistica la dice lunga.

->Geni non codificanti: Ci sono prove sperimentali che indicano che questa trascrizione inspiegata sia comunque in parte regolata, e questo suggerisce che i non-coding RNAs abbiano qualche funzione regolativa (del resto sono già noti alla comunità scientifica i micro-RNA e compagnia bella).

->Nuovi geni codificanti: Si ipotizza che ci possano essere dei geni ancora da scoprire e che questi vengano trascritti. Oppure possono essere degli pseudogeni che oramai hanno perso la loro funzione originaria.

Concludo con una nota. E’ normale che con le tecniche di analisi moderne e con il supporto della biologia computazionale le conoscenze che avevamo sul Genoma e sulla biologia in generale vangano stravolte. Semplicemente cambia il modo con cui vengono presi ed analizzati i dati e tutte le cose che prima davamo per certe ora vengono messe in discussione. In fondo tutti i dati che avevamo acquisito prima che le più moderne tecniche venissero messe a punto soffrivano di un grande difetto: il bias; tipico errore che si commette spesso quando si fanno esperimenti andando a cercare ciò che si vuole trovare, ignorando tutto il resto che magari non ci aspettiamo che ci sia e quindi non cerchiamo neppure. E’ normale che si trovassero solo trascritti di geni codificanti perchè non ci saremmo mai aspettati di trovare altro. Del resto le tecniche ancora non permettevano di fare altrimenti.

Se avete domande, suggerimenti, osservazioni critiche, insomma, se volete dire la vostra, non tiratevi indietro!

L’argomento riguarda, come potete dedurre dal titolo, le cellule staminali, e mi è venuto in mente leggendo questo articolo:

Prima di inziare, illustrerò brevemente cosa sono. Le cellule staminali (stem cells in inglese) sono delle cellule che non hanno ancora intrapreso nessuna via di differenziamento cellulare e sono in grado di dare forma a tutti i tipi cellulari di un organismo, se messe in un opportuno contesto. Sono in grado di dividersi e di rinnovarsi continuamente. Sono famose le cellule staminali embrionali, ma forse non tutti sanno che esistono popolazioni di cellule staminali anche in organismi adulti. Le potenzialità della ricerca in questo campo sono immense.. e le applicazioni che ne potrebbero derivare lo sono ancora di più. Non bisogna comunque dimentica i dibattiti etici sull’argomento.

Pochi anni fa, nel 2006, si è dimostrato, e quell’articolo ne è la prova, che delle cellule staminali possono essere derivate da delle cellule non staminali, attraverso un processo di de-differenziamento. Una scoperta stratosferica, perchè si pensava che il processo fosse irreversibile, e che ha permesso anche di scoprire alcuni dei meccanismi molecolari che inducono e mantengono la totipotenza.
L’esperimento è stato condotto da un gruppo di ricerca giapponese, ed ha ricavato cellule totipotenti da fibroblasti di topo, andandando ad attivare alcuni geni. Adesso vediamo come hanno lavorato.
Avevano in coltura delle cellule di topo già differenziate, i fibroblasti. Hanno svolto una ricerca, soprattutto bibliografica, per individuare quali fossero i geni fino ad ora conosciuti che erano conivolti nella staminalità delle cellule. Secondo questa ricerca, 24 geni si sono rivelati essere particolarmente decisivi. Partendo dal presupposto che questi geni all’interno della cellula differenziata non venissero espressi, hanno pensato bene di reintrodurli tutti assieme attraverso una tecnica di knock-in, che assieme a quella del knock-out meriterebbe da sola un post che forse prima o poi scriverò. Quindi alla fine della fiera, in queste cellule sono stati inseriti artificialmente questi geni, di modo che venissero espressi. E magia, le cellule diventavano staminali. Il passo successivo è stato quello di andare a vedere quali di questi 24 geni fossero critici per il mantenimento della totipotenza, ed uno per volta sono andati ad eliminare questi geni, per vedere gli effetti (uno dei modi migliori per studiare il ruolo di una cosa è quello di eliminarla e vedere cosa succede). ben quattro geni su ventiquattro si sono rivelati essere critici: Oct3/4, Sox2, c-Myc and Klf4. Senza anche solo uno di questi infatti, le cellule non diventavano totipotenti.
Lo stesso esperimento è stato poi condotto nel 2007 su cellule umane ed ha condotto agli stessi risultati. Capite bene che questo, oltre ad essere un passo importante nella comprensione dei meccanismi molecolari e genetici della staminalità, apre le porte ad una caterva di future applicazioni anche mediche, senza andare a scomodare gli embrioni e senza che filosofi e teologi possano brontolare (perdonatemi la frecciatina).
Ovviamente molto deve essere ancora fatto, però i risultati sembrano essere incoraggianti.

Se avete domande, dubbi o precisazioni da fare, ovviamente scrivete tutto nei commenti!

Alla prossima!

Come facciamo a preparare un’elettroforesi? Abbiamo bisogno di un gel, un supporto, generalmente di plastica, in cui inserire il gel e in cui attaccare gli elettrodi, un generatore di voltaggio, e una soluzione tampone, che serve a formare il contatto elettrico tra gli elettrodi e il gel (in pratica favorisce il flusso delle cariche). Esistono due tipi di gel: i gel di agarosio e i gel di poliacrilammide; L’agarosio è un derivato polisaccaridico di alcuni tipi di alghe, mentre l’acrilammide, che è il monomero che costituisce, appunto, le molecole di poliacrilammide, è una neurotossina e pertanto, durante la preparazione, questo gel va trattato con attenzione. Sin da ora vi dico che, qualora trovaste la sigla AGE, questa sta per: Agarose Gel Electrophoresis, mentre la sigla PAGE sta per:PolyacrylAmide gel Electrophoresis.
L’ultrastruttura di questi gel è costituita da pori, i quali permettono la migrazione delle molecole. Le dimesioni dei pori sono controllabili dall’operatore in base alla percentuale di Agarosio e di Acrilammide. Più i pori sono larghi, più facilmente le molecole migreranno, più sono stretti, e più, ovviamente, incontraranno resistenza.
Quando si prepara il gel, solitamente lo si allestisce diluendo l’agar o l’acrilammide in un tampone a temperature elevate (di solito si utilizza un microonde) e pertanto, inizialmente, il gel sarà liquido. Soltanto quando si raffredderà assumerà la tipica consistenza gelatinosa. Durante il raffreddamento, si inserisce alla sommità del gel un pettine (non quello per i capelli, ma la struttura è simile), i cui dentelli formeranno, nel futuro gel, dei pozzetti dentro ai quali si inseriranno i campioni da far correre.

il gel così formato verrà inserito nel supporto di plastica, i campioni verranno caricati nei rispettivi pozzetti (questa è una operazione che è divertente quanto stressante da eseguire, perchè è piuttosto difficile vedere i pozzetti trasparenti su un gel trasparente anch’esso; è perciò piuttosto facile rompere i pozzetti, oppure non centrarli e quindi riversare il campione al di fuori. Ci vuole solo un po’ di manualità, e ricorrere a qualche trucco, come mettere uno striscio di carta colorata sotto al gel in modo da far risaltare i pozzetti). Si ricopre il gel di soluzione tampone, si attaccano gli elettrodi (facendo attenzione e non invertirli), si aziona il generatore di voltaggio (generalmente 80V per 30 minuti) e si attende. quindi si preleva il gel e si mettono in evidenza le bande così ottenute. Generalmente, uno dei classici metodi per mettere in evidenza il DNA si basa sull’utilizzo di agenti intercalanti come l’etidio bromuro o il propidio ioduro che se eccitati con UV sono fluorescenti. Siccome però questi sono agenti cancerogeni molto pericolosi, ora si utilizzano altri agenti (SYBR GREEN).. anche se noi in laboratorio abbiamo usato il bromuro di etidio, ma lasciamo perdere. Per quanto riguarda le proteine, invece, si utilizzano altri coloranti, come il blue comassie. Più o meno, ecco come si presenta il tutto:

legenda:

Well: pozzetto
Buffer: Tampone
SDS-PAGE: Elettroforesi in Gel di PoliacrilAmmide con Sodio Dodecil Solfato (vedremo dopo cos’è questo componente)

Quest’immagine mostra chiaramente come le molecole grandi corrano di meno nel gel rispetto a quelle piccole. in questo caso sono mostrate proteine.

Ora due considerazioni di carattere tecnico. La prima riguarda il fatto che, come potete vedere nella figura, i pozzetti con i campioni da far correre sono in alto, o comunque ad un marigine del gel. Questo significa che dovremo fare attenzione a come posizioneremo gli elettrodi per far sì che i campioni corrano verso basso e non verso alto. se ho del DNA, questo avrà carica negativa; tenderà a spostarsi verso l’elettrodo positivo (l’anodo), che andrà pozionato quindi dalla parte opposta dei pozzetti. se noi lo posizonassimo sullo stesso lato, non otterremo nessuna corsa perchè lo spazio è troppo breve.
La seconda riguarda invece la preparazione dei campioni per la corsa. Ho detto all’inizio che la corsa elettroforetica sarà influenzata dal rapporto z/m. Ma dobbiamo tener conto anche di un altro fattore, ovvero la forma del campione, dove per forma intendo la struttura. Come sappiamo, sia gli acidi nucleici che le proteine hanno delle conformzioni piuttosto complesse, queste influenzano significativamente la corsa di un campione. Pertanto spesso si aggiungono dei denaturanti in modo da standardizzare la situazione. In più va detto che poichè le proteine possono avere carica variabile (gli amminoacidi hanno cariche diverse) si utilizza durante la corsa un agente che oltre a denaturarle, conferisce loro una omogenea carica negativa, in modo che la corsa avvenga solo in base alla MW, questo agente è l’SDS (sodio dodecil solfato).

Alla fine, dopo tutta questa tiritera, avrete un risultato simile:

In questo gel sono presenti due set di campioni  separai (DNA), uno superiore e uno inferiore.

le due strisce laterali di sinistra, quella superioe e qualla inferiore sono costituite da campioni standard di Mw note. Facendo quindi un confronto con queste bande, si può risalire al peso molecolare dei nostri campioni. Per una determinazione più precisa è possibile ricorrere alla seguente formula:

Rf= (Distanza migrazione del campione)/(distanza migrazione del colorante)

l’Rf è la mobilità elettroforetica; la distanza di migrazione del campione è la distanza percorsa dalla banda specifica dal pozzetto. Mentre la distanza del colorante è la distanza percorsa dal fronte del colorante. C’è una correlazione lineare tra l’Rf e il LogMw; si costruisce quindi una retta di taratura tra l’Rf e il LogMW dei campioni noti. Calcolando poi l’Rf dei nostri campioni da determinare, è facile risalire (grazie all’equazione della retta trovata) alla massa molecolare.

Ora vediamo un po’ di applicazioni pratiche: immaginamo di aver appena eseguito una PCR (per vedere cos’è in brevis una PCR potetevi leggervi un mio vecchio Post), e di voler vedere se abbiamo amplificato il frammento di DNA corretto, e se ci sono rumori di fondo (ovvero frammenti di DNA che si sono amplificati pur non essendo specifici ai primer). Io so (o in teoria dovrei sapere) le dimensioni  e la massa del mio frammento di DNA amplificato, e posso pertanto prelevare un’aliquota del mio campione, fare una corsa elettroforetica su un gel e vedere se si evidenzia  su questo gel una banda corrispondente al peso molecolare noto. Se la banda è nitida avremo avuto una amplificazione specifica, se invece vedremo sbavature, avremo ottenuto un’amplificazione indesiderata. Questo potrebbe farci indurre a ripetere l’esperimento.
L’elettroforesi è anche usata per la determinazione delle proteine presenti nel plasma (anzi, per meglio dire, nel siero) come ad esempio le immunoglobuline, le albumine, ecc…
Alcune tecniche di sequenziamento del DNA si basano sull’unione della PCR con l’elettroforesi. Insomma, l’elettroforesi è uno strumento estremamente utile e anche piuttosto semplice che è oramai insostituibile.

vi do un link molto molto bello, con molte immagini che vi illustreranno meglio il concetto:

Scienze a scuola

Per ultima cosa, è mio dovere aggiungere che esistono ovviamente diversi altri tipi di elettroforesi, come L’elettroforesi bidimensionale, e l’elttroforesi in campo pulsato, e che questo che ho appena spiegato è quello di base.

Come sempre, se avete dubbi, curiosità, domande, obiezioni, io sono qui. Ciau!

Esistono diversi tipi di vettori, qui ci concentreremo sui più utilizzati, ovvero i plasmidi. Un plasmide è una molecola di DNA circolare extracromosomiale naturalmente presente all’interno di alcuni batteri. Può avere dimensioni variabili e solitamente non è indispensabile al batterio, ma è in grado comunque di dare alcune capacità aggiuntive come ad esempio la resistenza ad alcuni antibiotici, la capacità di metabolizzare substrati particolari ecc. Viene replicato ad ogni divisione cellulare grazie alla presenza di una sequenza, detta origine di replicazione, riconosciuta dalle DNA polimerasi batteriche. In questo modo il batterio si assicura che la sua progenie avrà lo stesso plasmide. Capite, vero, il significato evolutivo di questo processo?

I ricercatori sfruttano questo potente mezzo per clonare i geni di interesse. I plasmidi utilizzati di solito sono sintetici e hanno una struttura simile:

Come vedete, è una molecola circolare. Ma ha anche molte altre caratteristiche, fin più interessanti. Innanzitutto, come ogni buon plasmide che si rispetti, ha un’origine di replicazione, indicata come ori. Le frecce indicano la direzione del plasmide, ovviamente quella canonica 5’-3. La freccia nera è il sito multiplo di clonaggio (MCS) o polylinker. È una sequenza piena di siti di restrizione noti, ovvero siti in cui gli enzimi di restrizione tagliano specificamente il DNA. Questo è di cruciale importanza. Se noi vogliamo inserire un gene in questo plasmide, dobbiamo procedere al taglio dello stesso. Ma non un taglio a caso, assolutamente no! Deve essere un taglio specifico (uno e uno solo, altrimenti il plasmide non potrà più ricomporsi circolarmente). Inoltre le due estremità del plasmide libere, derivanti da questo taglio, non dovranno essere nette, come se fossero state tagliate da un paio di forbici (in gergo le estremità di questo tipo vengono chiamate Blunt, da non confondere col cantante!), ma sfalsate; per sfalsate significa che uno dei due filamenti del DNA sporge rispetto all’altro (è chiaro che se un estremità ha il filamento 5’-3’ sporgente, l’altra estremità avrà sporgente il filamento opposto), in modo che queste estremità possano riappaiarsi molto facilmente, vengono dette infatti sticky ends, ovvero appiccicose. Come mostrato in figura:

Ebbene Questo taglio ci serve per poter inserire nel plasmide il nostro gene di interesse. Quest’ultimo, a sua volta, dovrà avere le estremità adatte per poter legarsi al plasmide. Per ottenere questo si legano alle estremità del gene degli oligonucleotidi e li si taglia con lo stesso enzima di restrizione che si usa nel plasmide, in questo modo le estremità appiccicose sono complementari, e si potrà avere l’inserimento del gene nel plasmide. l’enzima di restrizione non deve però tagliare il gene in altri punti, ma solo alle estremità, per questo si deve fare molta attenzione agli enzimi di restrizione da usare (esistono dei programmi che individuano tutti i siti di restrizione presenti in una data sequenza, è meglio usarli per sapere se ci sono enzimi di restrizione che tagliano nel MCS ma non nel gene). Per far legare il gene con il plasmide, si utilizza un enzima chiamato Ligasi; la reazione si chiama di Ligazione.In teoria, voi direte, è finito qua; nel senso, noi inseriamo il gene nel plasmide, e non paghi di ciò inseriamo il plasmide ricombinante nei batteri(questo processo è chiamato trasformazione). Mettiamo i batteri a crescere, felici e contenti, su un terreno solido e otteniamo tantissime copie del nostro plasmide, e quindi del nostro gene. Già, peccato che c’è un piccolissimo ed insignificante dettaglio. Se facessimo solo così noi non avremmo la possibilità di distinguere i batteri che hanno assunto il plasmide da quelli che non l’hanno assunto (la trasformazione è un processo a resa piuttosto bassa), e per di più non riusciremmo a distinguere i batteri che hanno assunto il plasmide ricombinante da quelli che hanno assunto il plasmide senza il nostro gene (anche la ligazione non ha una resa del 100%, e alcuni plasmidi possono richiudersi su se stessi senza incorporare il gene). Come fare? Be, i ricercatori hanno risolto il problema molto elegantemente. Una delle cose più ammirevoli nella scienza è come gli scienziati riescano a trovare degli escamotage eleganti e raffinati per aggirare i problemi. Torniamo per un attimo a visionare la mappa del plasmide; vedete la frecciona indicata con ampicillin (Ampicillina in italiano)? L’Ampicillina è un antibiotico, quindi letale per i batteri; Bene, questo indica che nel plasmide è presente un gene (ampicillin, appunto) in grado di dare resistenza al batterio nei confronti di questo antibiotico. Questo gene viene detto marcatore di selezione, perché ci permette di distinguere i batteri che hanno assunto il plasmide, da quelli che non l’hanno fatto, perché i primi cresceranno anche i presenza dell’antibiotico, mentre i secondi no. Ok, benissimo, ma non basta; non possiamo ancora distinguere i batteri con il plasmide ricombinante da quelli con il plasmide originale (senza il gene). Qui il discorso si fa complesso, ma estremamente interessante. Ritorniamo a vedere la mappa del plasmide. Nel sito multiplo di clonaggio è indicato LacZ. Questo LacZ è un gene (uno dei responsabili della metabolizzazione del lattosio nei batteri) che codifica per un enzima, la B-galattosidasi. Se il plasmide ha ricombinato con il gene, quest’ultimo si è andato ad inserire nel bel mezzo del gene LacZ, inattivandolo (perché il gene, ricordiamolo, si inserisce all’interno del sito multiplo di clonaggio) Come facciamo però a verificare se questo è avvenuto o meno? Semplice, nel terreno di coltura dove i batteri vengono fatti crescere, oltre all’Ampicillina (in questo caso, ma esistono anche altri antibiotici verso i quali si può indurre una resistenza) aggiungiamo non il lattosio, bensì l’X-Gal. Questa molecola viene riconosciuta dalla B-galattosidasi e metabolizzata. Quando viene metabolizzato, l’X-Gal rilascia un gruppo cromogeno in grado di dare una colorazione blu. Quindi, ricapitoliamo: se il batterio cresce in presenza di antibiotico, vuol dire che ha assunto il plasmide. Se la colonia risultante sarà di colore Blu, vuol dire che il gene LacZ funziona ancora e che quindi il gene di interesse non è stato incorporato nel plasmide. Se invece cresce una colonia bianca, vuol dire che LacZ è stato inattivato dal gene di nostro interesse. Questo metodo viene detto selezione blu/bianco. Per essere precisi, oltre all’X-gal è necessario aggiungere ai batteri anche un’altra molecola, chiamata IPTG, in grado di favorire l’espressione del gene LacZ. Quindi, quando, dopo l’incubazione dei batteri (dopo la trasformazione), tiriamo fuori le piastre e diamo un’occhiata, potremo farci un’idea delle colonie ricombinanti da quelle non ricombinanti in base al loro colore, ricordo infatti che una colonia deriva da una singola cellula progenitrice, quindi siamo sicuri che tutte le cellule di una colonia sono uguali tra di loro.Questo è uno dei tanti metodi possibili. Probabilmente è il più famoso, o, se non lo fosse, è se non altro quello che ho usato in laboratorio, quindi quello che vi so spiegare con più sicurezza.Come dicevo, i plasmidi non sono gli unici vettori disponibili. Sono i più facili e più economici da usare, ma hanno lo “svantaggio” di avere una piccola capacità, nel senso che non sono stabili con inserti troppo grossi. Quindi, in caso volessimo clonare il genoma di un animale o di una pianta, risulterebbero un po’ scomodi. Ci sono altri vettori, più adatti a questo genere di esperimenti: i cosmidi, gli YAC e i BAC. Degni di nota sono anche i fagi, ovvero dei virus che possono essere usati come vettori. Forse mi occuperò di loro in prossimi post, oppure c’è sempre la mitica Wikipedia, anche se consiglio quella inglese.
Per curiosità, il laboratorio che ho fatto, prevedeva il clonaggio di un gene: l’angiopietina2 umana. Questo gene codifica per una proteina omonima che è stata associata (e da qui il nome) alla formazione di nuovi vasi sanguigni, pertanto estremamente importante nello sviluppo di alcuni tumori. Abbiamo usato come un ceppo di Escherichia coli come batteri. La mappa del plasmide utilizzato è quella che ho postato.

Come sempre, se avete domande, precisazioni, correzioni da fare, io sono qui! Ciaoooo!

In particolari casi, tuttavia, se vengono modificati particolari geni, la cellula da una parte non riesce a ripararli, dall’altra non si autodistrugge, e si trasforma così in cellula cancerosa. I particolari geni di cui parlavo si dividono in due classi, o famiglie, quella degli oncogeni e quella degli oncosoppressori. Gli oncogeni sono geni che normalmente svolgono funzioni vitali per la cellula e se sono regolari sono chiamati protoncogeni, come acceleratori della proliferazione cellulare, o da inibitori dell’apoptosi (ma non solo); se questi vengono modificati in modo da essere sempre funzionanti o non disattivabili, allora si trasformano in oncogeni, e si genera un tumore. D’altra parte, gli oncosoppressori sono quei geni che normalmente rallentano la proliferazione, inducono apoptosi, ecc.. e se vengono modificati in maniera disattivante allora, non svolgendo più la loro azione di freno, si genera un tumore.

Fino a diverso tempo fa le cure per il cancro erano aspecifiche, nel senso che avevano effetti citotossici generali, sia sulle cellule tumorali, ma anche su quelle sane; è già da alcuni anni tuttavia che si sta cercando di seguire un’altra filosofia, ovvero di creare cure e terapie mirate per i diversi tipi di cancro, e personalizzate per ogni individuo, essendo ognuno di noi diverso dall’altro; questo richiede ovviamente approfondite conoscenze che abbiamo solo in parte. Tuttavia, appunto, proprio ieri ho sentito di questa nuova possibile cura (in via di sperimentazione, sia chiaro) che si basa sul silenziamento genico indotto dall’RNA
Per silenziamento genico intendiamo quel fenomeno attraverso il quale l’informazione contenuta in un gene non viene più utilizzata, e questo silenziamento può avvenire a più livelli:

1) A livello di trascrizione: il gene non viene più letto dalla RNApolimerasi II (che è quella che sintetizza gli mRNA, quelli che saranno tradotti in proteine), e quindi non viene più prodotto l’mRNA di quel gene.

2) A livello post-trascrizionale, il gene in questione viene trascritto e produce il suo RNA corrispondente, ma questo viene in qualche modo inattivato, e quindi non si ha la traduzione in proteina.

3) A livello della traduzione: ovvero si bloccano i processi che portano l’mRNA ad essere tradotto in proteina

4) A livello post-traduzionale: in qualche modo la proteina viene inattivata prima che riesca a completare le sue finzioni.

Quindi se in qualche modo noi riusciamo a bloccare l’espressione di un gene che sappiamo essere implicato nello sviluppo di un cancro, possiamo in qualche modo aumentare le probabilità che il cancro regredisca. Come facciamo a bloccare l’espressione di un gene? Uno dei metodi possibili è quello sperimentato dai ricercatori della Sapienza, e si basa su una scoperta fatta alla fine degli anni ’90 e all’inizio del nuovo millennio che ha evidenziato il ruolo di alcuni RNA non codificanti nel silenziare un gene bloccando l’mRNA di quest’ultimo (silenziamento genico post-trascrizionale). Questi RNA silenziatori sono stati chiamati siRNA (small interference RNA) e miRNA (microRNA). Vediamone i meccanismi di azione, che sono per alcuni punti in comune.
I siRNA sono degli RNA a doppio filamento (dsRNA: double-stranded-RNA) che se presenti in una cellula portano alla distruzione selettiva degli mRNA aventi la stessa sequenza di uno dei due filamenti dell’siRNA. In maniera semplificata, il siRNA viene tagliato da una endonucleasi a RNA (un enzima che opera dei tagli sull’RNA in sequenze specifiche) che è stata chiamata Dicer. Questo frammento più piccolo di RNA si associa ad un complesso proteico RISC, che lo divide in filamenti singoli, uno dei due filamenti singoli si lega ad un mRNA che ovviamente deve essere complementare, e l’mRNA viene degradato dal complesso . Probabilmente questo sistema silenziamento indotto si deve essere evoluto per proteggere la cellula da quei Virus che hanno il loro genoma sottoforma di dsRNA; eliminando l’RNA messaggero complementare al dsRNA, si diminuiscono le probabilità che la cellula traduca proteine virali.
I miRNA invece sono degli RNA a singolo filamento (ssRNA: single-stranded-RNA) sottoforma di doppio filamento (alcune sequenze interne sono complementari tra loro e si appaiano). Derivano da dei segmenti del genoma (invece i siRNA sono esogeni), e una volta sintetizzati vengono tagliati da un’altra endonucleasi  a RNA chiamata Drosha, il prodotto della reazione viene trasportato nel citosol e da lì in poi il meccanismo è identico a quello dei loro cugini siRNA.
La terapia contemplava l’utilizzo di particolari miRNA su animali affetti da tumore alla prostata, e i risultati sono stati molto promettenti.

Lascio qui di seguito alcuni link (come sempre, se avete domande o correzioni da fare, fate pure!)

Servizio del TG

Torinoscienza

Santa Wiki

Airc

Enjoy

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