Nonostante il titolo, non dovreste lasciarvi ingannare oramai, perchè dovreste sapere dove vado a parare di solito. Questo non è un post di etologia, ma di biologia molecolare e genetica.
Fino a qualche anno da si riteneva che in un organismo le due metà del patrimonio genetico derivanti dai due genitori contribuissero egualmente, ma si è scoperto che non è così. Per un gruppo di geni fare parte della linea materna o paterna è di fondamentale importanza per la sua futura attività.
L’imprinting è un termine che comunque è stato mutuato dall’etologia e indica proprio questo aspetto: un piccolo insieme di geni sono espressi esclusivamente dalla linea materna o dalla linea paterna e mai dall’altra. Non è incredibile? Questo fenomeno non è casuale, nel senso che geni che hanno un imprinting materno (che sono cioè espressi soltanto dall’allele di derivazione materna) conservano lo stesso imprinting in tutti gli organismi della stessa specie e probabilmente anche nelle specie affini. Molti dei geni “imprinted” nell’uomo, ad esempio, hanno lo stesso imprinting anche nel topo! In generale il fenomeno dell’imprintig è abbastanza conservato in tutti i mammiferi, ma è stato osservato ovunque negli eucarioti.
Non so se riusciate a comprendere la portata del fenomeno. Come diavolo possono essere distinti i geni in base linea parentale di appartenenza? Come è possibile che sempre lo stesso allele venga espresso? Sembra ovvio che non può essere questione di diversità di sequenza, perchè gli alleli sono in teoria identici.
Quindi ci deve essere qualcos’altro all’origine di questo strano fenomeno che viene trasmesso di generazione in generazione. Ci deve essere un modo per marcare il DNA in modo da poter identificare i geni in questione e soprattutto questa marcatura deve essere trasmessa di generazione in generazione.
A questo punto devo introdurre un concetto abbastanza complicato e che se anche all’inizio sembrerà che non c’entri nulla con quanto ho appena detto, in realtà è un passaggio fondamentale.
Tutti conosciamo il codice genetico, ma pochi conoscono il codice epigenetico. Il termine epigenetica indica un insieme di fenomeni che in qualche modo “stanno sopra” la genetica. Cosa vuol dire stare sopra? Non che sia più importante, ma soltanto che mentre il codice genetico si basa sulle sequenze nucleotidiche, le quali codificano informazioni ben precise come ben sappiamo, il codice epigenetico è un codice che non si basa sulle sequenze ma su altri elementi che adesso in breve spiegherò.
Questi elementi possono essere a carico del DNA stesso, come la metilazione (aggiunta di un gruppo -CH3) su entrambi i filamenti delle citosine in contesto CG; oppure possono essere a carico di una famiglia di proteine che interagiscono direttamente e fisicamente con il DNA e influenzano in modo determinante la trascrizione ed altri processi: gli istoni.
Cerco di spiegarmi meglio; il codice epigenetico è una sorta di linguaggio (come il codice genetico) e porta informazioni ben precise e fondamentali per lo sviluppo e la corretta funzione di una cellula. Questo linguaggio è costituito da un “alafabeto” che consiste principalmente in metilazione delle citosine in 5-metil-citosina quando le C sono precedute e/o seguite da una G. Questa metilazione avviene su entrambi i filamenti ad opera di una famiglia di enzimi chiamati DNMT (DNA-metil-transferasi). La metilazione sembra una modificazione insignificante, ma in realtà influenza pesantemente la struttura e la funzione del DNA.Diverse proteine si legano alle sequenze metilate e fanno in modo che il DNA assuma una conformazione densa e compatta e pressochè inattiva (eterocromatina). La metilazione non è l’unico elemento epigenetico, ma è l’unico ad interessare direttamente il DNA. Le altre modificazioni interessano delle proteine che sono strettamente associate al DNA gli istoni. Gli istoni sono le proteine che più frequentemente troviamo associate al DNA, il quale si avvolge letteralmente sopra. A seconda di come sono modificati gli istoni, il DNA può essere rilassato e attivo, oppure compatto ed inattivo. Però cosa si intende per compatto e per rilassato? Il DNA è approssimativamente un filo, quando è ripiegato tante volte su se stesso ed associato molto strettamente agli istoni allora è compatto; quando si trova in questo stato il DNA è inattivo perchè le proteine che sono necessarie alla trascrizione non riescono a legarsi all DNA stesso. Se invece il DNA è lineare è attivo perchè non ci sono ostacoli alla trascrizione.
Concentriamoci sulla metilazione delle citosine. Questa è l’unica modificazione che viene trasmessa e mantenuta da una cellula all’altra durante la divisione, ed è la responsabile della memoria cellulare! Cosa vuol dire? Vi siete mai chiesti come faccia una cellula già differenziata rimanere tale dopo la divisione cellulare? Come fa una cellula a sapere da che cellula deriva? Ricordatevi che una cellula quando si divide, replica e condensa tutti i cromosomi e li divide equamente tra le cellule figlie; queste ultime, una volta separate, decondensano i cromosomi e pertanto potrebbero in teoria decondensare ed attivare anche regioni che normalmente non dovrebbero essere attive in una cellula di quel tipo e diventare altre cellule. Come fanno a sapere cosa attivare e cosa no? Ok, mi direte voi, dal contesto e dal tessuto in cui si trova (se si trova in mezzo a epatociti diventerà epatocita); non è errata come risposta, ma non è sufficiente. E’ la metilazione che guida la memoria cellulare. Regioni metilate ed inattive nella cellula madre, saranno tenute metilate anche nelle cellule figlie, ad opera delle DNMT. Una cellula replica il suo DNA in maniera semiconservativa, pertanto le due copie di DNA che si formano avranno un filamento “vecchio” della cellula madre ed il complementare è invece appena sintetizzato. Pertanto le cellule figlie avranno soltanto un filamento di DNA che continua ad essere metilato,  quello della madre, mentre il complementare no! le DNMT riconoscono lecitosine in contesto CG metilate solo su un filamento e le metilano anche nel filamento complementare, mantenendo così intantta la meoria cellulare. Interessante non è vero???
Ok, spero di non avervi confuso le idee con questa digressione. Spero non abbiate perso il punto principale, ovvero l’imprinting. Ci eravamo chiesti quale “marcatura” potesse essere in grado di differenziare un allele dall’altro e che fosse in grado di trasmettersi lungo le generazioni. Come avrete già capito, questa marcatura è proprio la metilazione delle citosine. A questo punto si apre un problema. E’ noto che durante lo sviluppo embrionale sono le cellule staminali embrionali che danno origine all’individuo. Le cellule staminali embrionali (CSE) sono dedifferenziate e possono dare origine a qualsiasi cellula. Questo è possibile perchè il DNA dello zigote non appena c’è stata la fecondazione va incontro ad un ampio riarrangiamento e viene praticamente “demetilato” per cancellare la memoria cellulare e dare origine alle CSE. A questo seguirà una ondata di metilazione “de novo” che permetterà alle cellule di differenziarsi man mano che procede lo sviluppo. Non si conoscono ancora bene i meccanismi di questa nuova ondata di metilazione, però sta di fatto che se le metilazioni originali vanno perdute, come si fa a ristabilire l’imprinting nel modo corretto? Questo è possibile perchè non tutte le metilazioni vanno perdute, e tra le metilazioni che rimangono, ci sono quelle che regolano l’imprinting e pertanto questo viene conservato durante le generazioni.
Ora che abbiamo capito la logica che ci sta dietro, vediamo come sono regolati questi “imprinted genes”.  E’ stato notato che c’è una regione di DNA che può anche essere condivisa da più geni che può essere metilata o non metilata. Questa regione che può anche essere molto lunga è chiamata ICR (imprinted control region). E’ questa regione che è differentemente marcata tra le due linee parentali. Se è metilata su una linea non è metilata nell’altra. Solitamente le regioni metilate sono inattive, quindi la ICR metilata sarà un segnale di silenziamento genico.  Il discorso è però più complicato, perchè esistono due tipi di ICRs, ma non mi sembra il caso di addentrarmi ulteriormente.. mi sembra di aver messo già troppa carne al fuoco.

Spero di essere stato chiaro e non confusionario. spero di aver reso l’idea di quello che volevo dire! Se avete domande ovviamente siete caldissimamente invitate a farle. Così pure se volete semplicemente commentare o criticare!

Molto spesso nei libri di testo di biologia molecolare si trova pochissimo spazio dedicato a fenomeni che mi sembrano di grandissima rilevanza nella comprensione di molti processi. Probabilmente questo è dovuto al fatto che sovente non si hanno sufficienti informazioni, oppure se ce ne sono appaiono contraddittorie.
In questo piccolo intervento volevo parlare di una cosa secondo me di un interesse sconvolgente: l’organizzazione tridimensionale del genoma. Detto così non mi sembra di essere stato molto chiaro; cercherò di rifarmi qui di seguito.
Probabilmente molti di voi sono a conoscenza del fatto che la più grande unità organizzativa del genoma, eucariotico per lo più, è il cromosoma. Negli eucarioti ciascun cromosoma occupa un particolare volume nel nucleo cellulare chiamato territorio cromosomale e quel che più importa questo territorio, nel nucleo di una cellula in interfase, non è casuale.
Diversi lavori, tra cui uno in particolare a cui mi sto riferendo, hanno dimostrato che i diversi cromosomi di topo hanno un posizionamento tessuto-specifico all’interno del nucleo cellulare, con i cromosomi particolarmente ricchi di geni disposti verso il centro e quelli poveri di geni verso la periferia. Solitamente, inoltre, la maggior parte dei cromosomi disposti in periferia, erano per la maggior parte condensati in eterocromatina (e quindi trascrizionalmente inattivi).
La disposizione specifica dei cromosomi ha ancora degli aspetti poco chiari. Funzionalmente sembrerebbe servire per ottimizzare la regolazione dell’espressione genica, facendo in modo che geni che devono essere trascritti simultaneamente si trovino nella stessa area, aumentando così le probabilità che la trascrizione non solo avvenga, ma anche nei tempi corretti. Questo perché i geni trascritti intensamente si localizzano nelle cosiddette “fabbriche di trascrizione” (trascriptional factories suona meglio) che sono zone in cui la concentrazione di RNA polimerasi II e di fattori di trascrizione è particolarmente alta. Queste factories sembrano essere meno dei geni attivamente trascritti, pertanto è utile alla cellula localizzare tutti i geni utili in queste zone.
L’aspetto veramente interessante secondo me viene adesso: diversi geni, ma sarebbe più appropriato dire diversi loci, possono in qualche modo allontanarsi dal territorio del cromosoma di appartenenza, pur facendone ancora parte! Non so se sono stato chiaro; immaginate di avere dei gomitoli (supponendo che ciascun gomitolo sia fatto da un unico filo molto lungo e altamente convoluto) posizionati e fissi: questi sono i nostri cromosomi; ora prendete un ansa di filo di un gomitolo e tiratela in modo da farla districare dal resto per avere un loop fisicamente distante dal gomitolo di appartenenza, ma senza che ne sia staccato.
Quindi i cromosomi non solo non sono più entità fisse e statiche, ma i loro territori e i loro confini non sono più così netti come si pensava!
Alcuni cluster di loci, dove per cluster si intende gruppo, pur trovandosi su cromosomi differenti, riescono ad allontanarsi dal territorio di appartenenza, avvicinarsi, ed essere trascritti insieme, soprattutto se sono geni la cui funzione è correlata. Inoltre, che questo evento, di cui ci sono ancora diversi lati oscuri, sia almeno in parte correlato all’attivazione/repressione trascrizionale sembra essere dimostrato dal fatto che, inibendo la RNA polimerasi II, diminuisce significativamente.
Un fenomeno molto interessante che si è osservato, inoltre, riguarda il cromosoma X inattivato. Forse alcuni di voi sapranno che in cellule in cui è presente più di un cromosma X, (quindi negli esseri umani esclusivamente nelle femmine), solo uno di questi è attivo, mentre l’altro (o gli altri) è inattivato in maniera pressochè irreversibile. L’inattivazione del cromosoma X in più avviene attraverso una condensazione del DNA molto accentuata (eterocromatina); questa condensazione fa sì che i geni in questione non vengano trascritti. Quello che si è notato è che alcuni loci del cromosoma X inattivato sfuggono a questa condensazione proprio perché “scappano” dal territorio cromosomale. In questo modo evitano il silenziamento e sono belli attivi. Questo porta a dire due cose: la prima è che i geni, i loci in generale, non sono fissi, si muovono, si spostano all’interno del nucleo (pur rimanendo sempre al loro posto nel cromosoma); se questo movimento sia attivo o passivo non si sa. Al momento ignoro anche se sono stati scoperti dei “motori molecolari” che eseguono questo spostamento.
La seconda cosa, forse ancora più importante è che spesso si tende ad ignorare una cosa in biologia: il contesto spazio/temporale. Gli eventi, i processi che si svolgono sono influenzati sia dal tempo (nel senso che un evento non ha le stesse probabilità di avvenire in ogni istante, ma avrà dei momenti in cui le probabilità saranno maggiori o minori) che dallo spazio: in questo caso abbiamo visto come l’attivazione dei geni sia dovuta al luogo ed al momento in cui si vengono a trovare. Questo sembra banale, però io personalmente non ho quasi mai visto sui testi un accenno a queste due variabili, che pure, voglio dire, sono di fondamentale importanza.

Come sempre, spero di non avervi annoiato. Scrivete commenti e se avete qualsiasi osservazione o critica da fare, fatela!

Al prossimo post (chissà, magari varierò un po’ ..)

Sì.. lo so che sotto esami sarebbe meglio concentrarsi sullo studio, ma è più forte di me!

Il titolo di questo post è molto chiaro (o forse no?). Parliamo di materia oscura, ma non la materia oscura dell’universo.. di quella se ne occupano i fisici.. Ma parliamo della materia oscura del genoma. Interessante analogia. Questo, devo dirlo subito, non sarà un post in cui troverete spiegazioni, perchè spiegazioni al momento non ce ne sono, ma solo ipotesi. Questo post più che altro è fatto di domande.

Il genoma è una struttura molto complessa, il cui funzionamento non è del tutto chiaro. Direi anzi che sappiamo pochissimo su come funziona! Dai batteri fino a noi, il genoma ha subito un’evoluzione che l’ha portato, non solo ad ingrandirsi, ma anche ad incorporare sequenze dal significato per ora ignoto.

Qui trovate un elenco di alcuni organismi, dai lieviti fino a noi, ordinati secondo le dimensioni del genoma, espresse in megabasi Mb (1Mb= 10^6 basi).
Una tale differenza di dimesioni non è però linearmente proporzionale nè al numero di geni presenti, nè alla complessità dell’organismo.

E’ chiaro che c’è qualcosa che non va. Qualche calcolo che non torna.  Noi abbiamo circa 30 mila geni, un nematode 19000. un moscerino 13000. Per non parlare della densità genica. La densità genica del lievito è più di 40 volte la nostra.  Perchè questo? Perchè, come dicevo prima, il genoma nel corso dell’evoluzione ha acquisito moltissime sequenze non codificanti, dal significato ignoto, che fino a qualche anno fa veniva chiamato DNA spazzatura (Junk-DNA). Da cosa è composto questo DNA non codificante?

Sequenze regolatrici (promotori, enhancers), introni, sequenze altamente ripetute (satelliti, minisatelliti, microsatelliti), trasposoni (sequenze che si spostano all’interno del genoma), sequenze di origine virale e così via. Il tutto rende il DNA codificante appena l’1.5% di tutto il genoma!
Ci sono diverse teorie al riguardo. Secondo la teoria del gene egoista, questo sarebbe DNA parassita che sfrutta il DNA funzionante per propagarsi; secondo altri rappresenta un meccanismo di difesa: una mutazione ha molte più probabilità di generarsi in queste sequenze non codificanti, che nei geni.

Comunque si credeva che queste sequenze non solo non codificassero per proteine, ma che non venissero neppure trascritte. Del resto non aveva senso che fosse il contrario. La trascrizione è un meccanismo complessissimo, altamente regolato e soprattutto dispendioso dal punto di vista energetico. Non ha senso che vengano trascritte sequenze inutili.
Tuttavia, qualcosa ci deve essere sfuggito, perchè con le moderne tecniche di analisi del trascrittoma (tiling arrays, RNA-seq) si è scoperto proprio quello che non ci saremmo mai aspettati: molte sequenze di RNA si allineano perfettamente con sequenze genomiche non codificanti. Perchè mai, se è inutile, viene trascritto? Forse del tutto inutile non è. Forse abbiamo sbagliato noi, forse dovremmo evitare di chiamare inutile ogni cosa che non sappiamo cosa faccia.
E’ proprio questa la materia oscura a cui fa riferimento il titolo: sequenze di RNA trascritte non codificanti che aspettano ancora di essere classificate.
Ci sono delle ipotesi che tentano di inquadrare questo fenomeno, che ovviamente andranno verificate:

->Artefatti biologici: (per artefatto si intende comunemente errore) ovvero originano da una trascrizione non specifica e a bassa intensità del DNA, e siccome le il DNA non codificante è la maggior parte, la statistica la dice lunga.

->Geni non codificanti: Ci sono prove sperimentali che indicano che questa trascrizione inspiegata sia comunque in parte regolata, e questo suggerisce che i non-coding RNAs abbiano qualche funzione regolativa (del resto sono già noti alla comunità scientifica i micro-RNA e compagnia bella).

->Nuovi geni codificanti: Si ipotizza che ci possano essere dei geni ancora da scoprire e che questi vengano trascritti. Oppure possono essere degli pseudogeni che oramai hanno perso la loro funzione originaria.

Concludo con una nota. E’ normale che con le tecniche di analisi moderne e con il supporto della biologia computazionale le conoscenze che avevamo sul Genoma e sulla biologia in generale vangano stravolte. Semplicemente cambia il modo con cui vengono presi ed analizzati i dati e tutte le cose che prima davamo per certe ora vengono messe in discussione. In fondo tutti i dati che avevamo acquisito prima che le più moderne tecniche venissero messe a punto soffrivano di un grande difetto: il bias; tipico errore che si commette spesso quando si fanno esperimenti andando a cercare ciò che si vuole trovare, ignorando tutto il resto che magari non ci aspettiamo che ci sia e quindi non cerchiamo neppure. E’ normale che si trovassero solo trascritti di geni codificanti perchè non ci saremmo mai aspettati di trovare altro. Del resto le tecniche ancora non permettevano di fare altrimenti.

Se avete domande, suggerimenti, osservazioni critiche, insomma, se volete dire la vostra, non tiratevi indietro!

Rieccomi spuntare dall’oltretomba! sono qui per scrivere un post su un argomento che mi ha colpito, nonchè affascinato molto, e vorrei condividerlo con voi.

L’argomento riguarda, come potete dedurre dal titolo, le cellule staminali, e mi è venuto in mente leggendo questo articolo:

Prima di inziare, illustrerò brevemente cosa sono. Le cellule staminali (stem cells in inglese) sono delle cellule che non hanno ancora intrapreso nessuna via di differenziamento cellulare e sono in grado di dare forma a tutti i tipi cellulari di un organismo, se messe in un opportuno contesto. Sono in grado di dividersi e di rinnovarsi continuamente. Sono famose le cellule staminali embrionali, ma forse non tutti sanno che esistono popolazioni di cellule staminali anche in organismi adulti. Le potenzialità della ricerca in questo campo sono immense.. e le applicazioni che ne potrebbero derivare lo sono ancora di più. Non bisogna comunque dimentica i dibattiti etici sull’argomento.

Pochi anni fa, nel 2006, si è dimostrato, e quell’articolo ne è la prova, che delle cellule staminali possono essere derivate da delle cellule non staminali, attraverso un processo di de-differenziamento. Una scoperta stratosferica, perchè si pensava che il processo fosse irreversibile, e che ha permesso anche di scoprire alcuni dei meccanismi molecolari che inducono e mantengono la totipotenza.
L’esperimento è stato condotto da un gruppo di ricerca giapponese, ed ha ricavato cellule totipotenti da fibroblasti di topo, andandando ad attivare alcuni geni. Adesso vediamo come hanno lavorato.
Avevano in coltura delle cellule di topo già differenziate, i fibroblasti. Hanno svolto una ricerca, soprattutto bibliografica, per individuare quali fossero i geni fino ad ora conosciuti che erano conivolti nella staminalità delle cellule. Secondo questa ricerca, 24 geni si sono rivelati essere particolarmente decisivi. Partendo dal presupposto che questi geni all’interno della cellula differenziata non venissero espressi, hanno pensato bene di reintrodurli tutti assieme attraverso una tecnica di knock-in, che assieme a quella del knock-out meriterebbe da sola un post che forse prima o poi scriverò. Quindi alla fine della fiera, in queste cellule sono stati inseriti artificialmente questi geni, di modo che venissero espressi. E magia, le cellule diventavano staminali. Il passo successivo è stato quello di andare a vedere quali di questi 24 geni fossero critici per il mantenimento della totipotenza, ed uno per volta sono andati ad eliminare questi geni, per vedere gli effetti (uno dei modi migliori per studiare il ruolo di una cosa è quello di eliminarla e vedere cosa succede). ben quattro geni su ventiquattro si sono rivelati essere critici: Oct3/4, Sox2, c-Myc and Klf4. Senza anche solo uno di questi infatti, le cellule non diventavano totipotenti.
Lo stesso esperimento è stato poi condotto nel 2007 su cellule umane ed ha condotto agli stessi risultati. Capite bene che questo, oltre ad essere un passo importante nella comprensione dei meccanismi molecolari e genetici della staminalità, apre le porte ad una caterva di future applicazioni anche mediche, senza andare a scomodare gli embrioni e senza che filosofi e teologi possano brontolare (perdonatemi la frecciatina).
Ovviamente molto deve essere ancora fatto, però i risultati sembrano essere incoraggianti.

Se avete domande, dubbi o precisazioni da fare, ovviamente scrivete tutto nei commenti!

Alla prossima!

L’elettroforesi è una tecnica basilare non solo della biologia, ma anche della diagnostica in generale. Trova un sacco di applicazioni dovute alla sua versatilità. Le elettroforesi più comunemente utilizzate solo le elettroforesi su Gel e si basano sulla capacità delle molecole biologiche di migrare in un campo elettrico. Questa capacità è dovuta dal fatto che la macromolecola biologica possiede una carica elettrica totale, positiva o negativa, e quindi, se posta in un campo elettrico, migrerà verso l’elettrodo di carica opposta.  Questa capacità di far migrare una carica in un campo elettrico può essere sfruttata per separare  le nostre molecole in base al loro rapporto z/m dove z solitamente simboleggia la carica e m, ovviamente, la massa, (anche se, parlando di molecole, dovrebbe essere Mw: molecoular weight e misurarsi non in grammi ma in dalton, ma alla fine è il concetto ad interessarci).
Le molecole che di solito vengono separate in elettroforesi sono solitamente gli acidi nucleici (DNA, RNA) e le proteine. essendo due classi di molecole diverse, meritano attenzioni distinte. Ora passiamo ad illustrare la tecnica in generale.

Come facciamo a preparare un’elettroforesi? Abbiamo bisogno di un gel, un supporto, generalmente di plastica, in cui inserire il gel e in cui attaccare gli elettrodi, un generatore di voltaggio, e una soluzione tampone, che serve a formare il contatto elettrico tra gli elettrodi e il gel (in pratica favorisce il flusso delle cariche). Esistono due tipi di gel: i gel di agarosio e i gel di poliacrilammide; L’agarosio è un derivato polisaccaridico di alcuni tipi di alghe, mentre l’acrilammide, che è il monomero che costituisce, appunto, le molecole di poliacrilammide, è una neurotossina e pertanto, durante la preparazione, questo gel va trattato con attenzione. Sin da ora vi dico che, qualora trovaste la sigla AGE, questa sta per: Agarose Gel Electrophoresis, mentre la sigla PAGE sta per:PolyacrylAmide gel Electrophoresis.
L’ultrastruttura di questi gel è costituita da pori, i quali permettono la migrazione delle molecole. Le dimesioni dei pori sono controllabili dall’operatore in base alla percentuale di Agarosio e di Acrilammide. Più i pori sono larghi, più facilmente le molecole migreranno, più sono stretti, e più, ovviamente, incontraranno resistenza.
Quando si prepara il gel, solitamente lo si allestisce diluendo l’agar o l’acrilammide in un tampone a temperature elevate (di solito si utilizza un microonde) e pertanto, inizialmente, il gel sarà liquido. Soltanto quando si raffredderà assumerà la tipica consistenza gelatinosa. Durante il raffreddamento, si inserisce alla sommità del gel un pettine (non quello per i capelli, ma la struttura è simile), i cui dentelli formeranno, nel futuro gel, dei pozzetti dentro ai quali si inseriranno i campioni da far correre.

il gel così formato verrà inserito nel supporto di plastica, i campioni verranno caricati nei rispettivi pozzetti (questa è una operazione che è divertente quanto stressante da eseguire, perchè è piuttosto difficile vedere i pozzetti trasparenti su un gel trasparente anch’esso; è perciò piuttosto facile rompere i pozzetti, oppure non centrarli e quindi riversare il campione al di fuori. Ci vuole solo un po’ di manualità, e ricorrere a qualche trucco, come mettere uno striscio di carta colorata sotto al gel in modo da far risaltare i pozzetti). Si ricopre il gel di soluzione tampone, si attaccano gli elettrodi (facendo attenzione e non invertirli), si aziona il generatore di voltaggio (generalmente 80V per 30 minuti) e si attende. quindi si preleva il gel e si mettono in evidenza le bande così ottenute. Generalmente, uno dei classici metodi per mettere in evidenza il DNA si basa sull’utilizzo di agenti intercalanti come l’etidio bromuro o il propidio ioduro che se eccitati con UV sono fluorescenti. Siccome però questi sono agenti cancerogeni molto pericolosi, ora si utilizzano altri agenti (SYBR GREEN).. anche se noi in laboratorio abbiamo usato il bromuro di etidio, ma lasciamo perdere. Per quanto riguarda le proteine, invece, si utilizzano altri coloranti, come il blue comassie. Più o meno, ecco come si presenta il tutto:

legenda:

Well: pozzetto
Buffer: Tampone
SDS-PAGE: Elettroforesi in Gel di PoliacrilAmmide con Sodio Dodecil Solfato (vedremo dopo cos’è questo componente)

Quest’immagine mostra chiaramente come le molecole grandi corrano di meno nel gel rispetto a quelle piccole. in questo caso sono mostrate proteine.

Ora due considerazioni di carattere tecnico. La prima riguarda il fatto che, come potete vedere nella figura, i pozzetti con i campioni da far correre sono in alto, o comunque ad un marigine del gel. Questo significa che dovremo fare attenzione a come posizioneremo gli elettrodi per far sì che i campioni corrano verso basso e non verso alto. se ho del DNA, questo avrà carica negativa; tenderà a spostarsi verso l’elettrodo positivo (l’anodo), che andrà pozionato quindi dalla parte opposta dei pozzetti. se noi lo posizonassimo sullo stesso lato, non otterremo nessuna corsa perchè lo spazio è troppo breve.
La seconda riguarda invece la preparazione dei campioni per la corsa. Ho detto all’inizio che la corsa elettroforetica sarà influenzata dal rapporto z/m. Ma dobbiamo tener conto anche di un altro fattore, ovvero la forma del campione, dove per forma intendo la struttura. Come sappiamo, sia gli acidi nucleici che le proteine hanno delle conformzioni piuttosto complesse, queste influenzano significativamente la corsa di un campione. Pertanto spesso si aggiungono dei denaturanti in modo da standardizzare la situazione. In più va detto che poichè le proteine possono avere carica variabile (gli amminoacidi hanno cariche diverse) si utilizza durante la corsa un agente che oltre a denaturarle, conferisce loro una omogenea carica negativa, in modo che la corsa avvenga solo in base alla MW, questo agente è l’SDS (sodio dodecil solfato).

Alla fine, dopo tutta questa tiritera, avrete un risultato simile:

In questo gel sono presenti due set di campioni  separai (DNA), uno superiore e uno inferiore.

le due strisce laterali di sinistra, quella superioe e qualla inferiore sono costituite da campioni standard di Mw note. Facendo quindi un confronto con queste bande, si può risalire al peso molecolare dei nostri campioni. Per una determinazione più precisa è possibile ricorrere alla seguente formula:

Rf= (Distanza migrazione del campione)/(distanza migrazione del colorante)

l’Rf è la mobilità elettroforetica; la distanza di migrazione del campione è la distanza percorsa dalla banda specifica dal pozzetto. Mentre la distanza del colorante è la distanza percorsa dal fronte del colorante. C’è una correlazione lineare tra l’Rf e il LogMw; si costruisce quindi una retta di taratura tra l’Rf e il LogMW dei campioni noti. Calcolando poi l’Rf dei nostri campioni da determinare, è facile risalire (grazie all’equazione della retta trovata) alla massa molecolare.

Ora vediamo un po’ di applicazioni pratiche: immaginamo di aver appena eseguito una PCR (per vedere cos’è in brevis una PCR potetevi leggervi un mio vecchio Post), e di voler vedere se abbiamo amplificato il frammento di DNA corretto, e se ci sono rumori di fondo (ovvero frammenti di DNA che si sono amplificati pur non essendo specifici ai primer). Io so (o in teoria dovrei sapere) le dimensioni  e la massa del mio frammento di DNA amplificato, e posso pertanto prelevare un’aliquota del mio campione, fare una corsa elettroforetica su un gel e vedere se si evidenzia  su questo gel una banda corrispondente al peso molecolare noto. Se la banda è nitida avremo avuto una amplificazione specifica, se invece vedremo sbavature, avremo ottenuto un’amplificazione indesiderata. Questo potrebbe farci indurre a ripetere l’esperimento.
L’elettroforesi è anche usata per la determinazione delle proteine presenti nel plasma (anzi, per meglio dire, nel siero) come ad esempio le immunoglobuline, le albumine, ecc…
Alcune tecniche di sequenziamento del DNA si basano sull’unione della PCR con l’elettroforesi. Insomma, l’elettroforesi è uno strumento estremamente utile e anche piuttosto semplice che è oramai insostituibile.

vi do un link molto molto bello, con molte immagini che vi illustreranno meglio il concetto:

Scienze a scuola

Per ultima cosa, è mio dovere aggiungere che esistono ovviamente diversi altri tipi di elettroforesi, come L’elettroforesi bidimensionale, e l’elttroforesi in campo pulsato, e che questo che ho appena spiegato è quello di base.

Come sempre, se avete dubbi, curiosità, domande, obiezioni, io sono qui. Ciau!

Ok, rieccomi! So che aspettavate da tanto il mio ritorno. (certo certo, come no..). Allora, questo Post è dedicato ad un aspetto molto interessante della biologia molecolare di base, il clonaggio. Un clone è, come sapete, un organismo esattamente uguale ad un altro dal punto di vista genetico. Ora, per clonaggio io non intendevo quello che è stato fatto con la pecora Dolly (vi ricordate?), ma mi riferivo al clonaggio di singoli geni. Perché spesso per i ricercatori è molto utile avere grandi quantità di singoli geni, perché in questo modo è possibile sequenziarli o utilizzarli come sonde per studiarne l’espressione in tessuti o organismi. Oppure, per inciso, è anche possibile spezzettare il genoma di un organismo, clonare i singoli frammenti, e ottenere così le cosiddette librerie (library) nelle quali vengono conservati questi frammenti di DNA e utilizzati quando occorre; esistono diverse tipi di library, ma non è questo l’argomento del post.
Vi dicevo, appunto, clonaggio di geni. Per clonare un gene, ma è anche possibile clonare diversi geni contemporaneamente, possiamo sfruttare la potenza e l’efficienza di uno strumento di cui la natura già dispone, ovvero l’alta capacità replicativa dei microorganismi. Se noi, quindi, riusciamo ad inserire il gene di nostro interesse in un batterio od in un lievito e lo lasciamo replicare, otterremo molte copie del gene di partenza. Il problema è: come introduciamo questo gene? Alcuni microrganismi hanno la capacità di assumere DNA dall’ambiente esterno, ma è un processo raro e poco efficiente, senza contare che, se non si inserisce nel cromosoma batterico, non verrà tramandato alla progenie, rendendo il clonaggio impossibile. Vengono così utilizzati dei vettori (sempre delle molecole di DNA) in cui inizialmente si inserisce il gene di interesse, e secondariamente si fa in modo che questo vettore venga assunto dal microorganismo. Cosa cambia, direte voi, inserire il gene singolarmente dall’inserirlo come parte di una molecola di DNA più grande? Cambia eccome, e ora vediamo il perché.

Esistono diversi tipi di vettori, qui ci concentreremo sui più utilizzati, ovvero i plasmidi. Un plasmide è una molecola di DNA circolare extracromosomiale naturalmente presente all’interno di alcuni batteri. Può avere dimensioni variabili e solitamente non è indispensabile al batterio, ma è in grado comunque di dare alcune capacità aggiuntive come ad esempio la resistenza ad alcuni antibiotici, la capacità di metabolizzare substrati particolari ecc. Viene replicato ad ogni divisione cellulare grazie alla presenza di una sequenza, detta origine di replicazione, riconosciuta dalle DNA polimerasi batteriche. In questo modo il batterio si assicura che la sua progenie avrà lo stesso plasmide. Capite, vero, il significato evolutivo di questo processo?

I ricercatori sfruttano questo potente mezzo per clonare i geni di interesse. I plasmidi utilizzati di solito sono sintetici e hanno una struttura simile:

Come vedete, è una molecola circolare. Ma ha anche molte altre caratteristiche, fin più interessanti. Innanzitutto, come ogni buon plasmide che si rispetti, ha un’origine di replicazione, indicata come ori. Le frecce indicano la direzione del plasmide, ovviamente quella canonica 5’-3. La freccia nera è il sito multiplo di clonaggio (MCS) o polylinker. È una sequenza piena di siti di restrizione noti, ovvero siti in cui gli enzimi di restrizione tagliano specificamente il DNA. Questo è di cruciale importanza. Se noi vogliamo inserire un gene in questo plasmide, dobbiamo procedere al taglio dello stesso. Ma non un taglio a caso, assolutamente no! Deve essere un taglio specifico (uno e uno solo, altrimenti il plasmide non potrà più ricomporsi circolarmente). Inoltre le due estremità del plasmide libere, derivanti da questo taglio, non dovranno essere nette, come se fossero state tagliate da un paio di forbici (in gergo le estremità di questo tipo vengono chiamate Blunt, da non confondere col cantante!), ma sfalsate; per sfalsate significa che uno dei due filamenti del DNA sporge rispetto all’altro (è chiaro che se un estremità ha il filamento 5’-3’ sporgente, l’altra estremità avrà sporgente il filamento opposto), in modo che queste estremità possano riappaiarsi molto facilmente, vengono dette infatti sticky ends, ovvero appiccicose. Come mostrato in figura:

Ebbene Questo taglio ci serve per poter inserire nel plasmide il nostro gene di interesse. Quest’ultimo, a sua volta, dovrà avere le estremità adatte per poter legarsi al plasmide. Per ottenere questo si legano alle estremità del gene degli oligonucleotidi e li si taglia con lo stesso enzima di restrizione che si usa nel plasmide, in questo modo le estremità appiccicose sono complementari, e si potrà avere l’inserimento del gene nel plasmide. l’enzima di restrizione non deve però tagliare il gene in altri punti, ma solo alle estremità, per questo si deve fare molta attenzione agli enzimi di restrizione da usare (esistono dei programmi che individuano tutti i siti di restrizione presenti in una data sequenza, è meglio usarli per sapere se ci sono enzimi di restrizione che tagliano nel MCS ma non nel gene). Per far legare il gene con il plasmide, si utilizza un enzima chiamato Ligasi; la reazione si chiama di Ligazione.In teoria, voi direte, è finito qua; nel senso, noi inseriamo il gene nel plasmide, e non paghi di ciò inseriamo il plasmide ricombinante nei batteri(questo processo è chiamato trasformazione). Mettiamo i batteri a crescere, felici e contenti, su un terreno solido e otteniamo tantissime copie del nostro plasmide, e quindi del nostro gene. Già, peccato che c’è un piccolissimo ed insignificante dettaglio. Se facessimo solo così noi non avremmo la possibilità di distinguere i batteri che hanno assunto il plasmide da quelli che non l’hanno assunto (la trasformazione è un processo a resa piuttosto bassa), e per di più non riusciremmo a distinguere i batteri che hanno assunto il plasmide ricombinante da quelli che hanno assunto il plasmide senza il nostro gene (anche la ligazione non ha una resa del 100%, e alcuni plasmidi possono richiudersi su se stessi senza incorporare il gene). Come fare? Be, i ricercatori hanno risolto il problema molto elegantemente. Una delle cose più ammirevoli nella scienza è come gli scienziati riescano a trovare degli escamotage eleganti e raffinati per aggirare i problemi. Torniamo per un attimo a visionare la mappa del plasmide; vedete la frecciona indicata con ampicillin (Ampicillina in italiano)? L’Ampicillina è un antibiotico, quindi letale per i batteri; Bene, questo indica che nel plasmide è presente un gene (ampicillin, appunto) in grado di dare resistenza al batterio nei confronti di questo antibiotico. Questo gene viene detto marcatore di selezione, perché ci permette di distinguere i batteri che hanno assunto il plasmide, da quelli che non l’hanno fatto, perché i primi cresceranno anche i presenza dell’antibiotico, mentre i secondi no. Ok, benissimo, ma non basta; non possiamo ancora distinguere i batteri con il plasmide ricombinante da quelli con il plasmide originale (senza il gene). Qui il discorso si fa complesso, ma estremamente interessante. Ritorniamo a vedere la mappa del plasmide. Nel sito multiplo di clonaggio è indicato LacZ. Questo LacZ è un gene (uno dei responsabili della metabolizzazione del lattosio nei batteri) che codifica per un enzima, la B-galattosidasi. Se il plasmide ha ricombinato con il gene, quest’ultimo si è andato ad inserire nel bel mezzo del gene LacZ, inattivandolo (perché il gene, ricordiamolo, si inserisce all’interno del sito multiplo di clonaggio) Come facciamo però a verificare se questo è avvenuto o meno? Semplice, nel terreno di coltura dove i batteri vengono fatti crescere, oltre all’Ampicillina (in questo caso, ma esistono anche altri antibiotici verso i quali si può indurre una resistenza) aggiungiamo non il lattosio, bensì l’X-Gal. Questa molecola viene riconosciuta dalla B-galattosidasi e metabolizzata. Quando viene metabolizzato, l’X-Gal rilascia un gruppo cromogeno in grado di dare una colorazione blu. Quindi, ricapitoliamo: se il batterio cresce in presenza di antibiotico, vuol dire che ha assunto il plasmide. Se la colonia risultante sarà di colore Blu, vuol dire che il gene LacZ funziona ancora e che quindi il gene di interesse non è stato incorporato nel plasmide. Se invece cresce una colonia bianca, vuol dire che LacZ è stato inattivato dal gene di nostro interesse. Questo metodo viene detto selezione blu/bianco. Per essere precisi, oltre all’X-gal è necessario aggiungere ai batteri anche un’altra molecola, chiamata IPTG, in grado di favorire l’espressione del gene LacZ. Quindi, quando, dopo l’incubazione dei batteri (dopo la trasformazione), tiriamo fuori le piastre e diamo un’occhiata, potremo farci un’idea delle colonie ricombinanti da quelle non ricombinanti in base al loro colore, ricordo infatti che una colonia deriva da una singola cellula progenitrice, quindi siamo sicuri che tutte le cellule di una colonia sono uguali tra di loro.Questo è uno dei tanti metodi possibili. Probabilmente è il più famoso, o, se non lo fosse, è se non altro quello che ho usato in laboratorio, quindi quello che vi so spiegare con più sicurezza.Come dicevo, i plasmidi non sono gli unici vettori disponibili. Sono i più facili e più economici da usare, ma hanno lo “svantaggio” di avere una piccola capacità, nel senso che non sono stabili con inserti troppo grossi. Quindi, in caso volessimo clonare il genoma di un animale o di una pianta, risulterebbero un po’ scomodi. Ci sono altri vettori, più adatti a questo genere di esperimenti: i cosmidi, gli YAC e i BAC. Degni di nota sono anche i fagi, ovvero dei virus che possono essere usati come vettori. Forse mi occuperò di loro in prossimi post, oppure c’è sempre la mitica Wikipedia, anche se consiglio quella inglese.
Per curiosità, il laboratorio che ho fatto, prevedeva il clonaggio di un gene: l’angiopietina2 umana. Questo gene codifica per una proteina omonima che è stata associata (e da qui il nome) alla formazione di nuovi vasi sanguigni, pertanto estremamente importante nello sviluppo di alcuni tumori. Abbiamo usato come un ceppo di Escherichia coli come batteri. La mappa del plasmide utilizzato è quella che ho postato.

Come sempre, se avete domande, precisazioni, correzioni da fare, io sono qui! Ciaoooo!

Ho sentito ieri sera al Tg La7 una notizia interessante: dei ricercatori della Sapienza hanno ottenuto risultati interessanti su una cura per il carcinoma alla prostata, basato sul silenziamento genico indotto dall’RNA. Dunque, poiché questo post è rivolto a chiunque abbia un po’ di interesse, voglio fare alcuni accenni introduttivi.
Ogni organismo ha un suo genoma, ovvero l’insieme dei suoi geni. Questi geni portano nella loro sequenza nucleotidica un’informazione specifica che per venire utilizzata deve essere tradotta dal linguaggio del DNA a quello delle proteine (non è sempre così, ma assumiamo per semplificazione di sì) e questa traduzione avviene mediante un trascritto intermedio di RNA (chiamato RNA messaggero, o mRNA), sintetizzato da una RNApolimerasi II utilizzando il DNA del gene in questione come stampo. Ora, la cellula non trascrive sempre e continuamente tutti i geni che ha nel suo genoma,  ma attraverso un complicato processo di regolazione genica, che si esplica a più livelli, seleziona i geni da trascrivere; alcuni saranno sempre trascritti durante la sua vita, i cosiddetti geni housekeeper, altri geni saranno trascritti se e quando ce ne sarà il bisogno, ad esempio in risposta a stimoli esterni, altri invece non verranno mai trascritti da quella cellula.
Un cancro è una malattia genetica, risultante da un cambiamento della sequenza di particolari geni; siccome ho già scritto un post in proposito, ve ne copio un pezzo, per rinfrescare la memoria:

In particolari casi, tuttavia, se vengono modificati particolari geni, la cellula da una parte non riesce a ripararli, dall’altra non si autodistrugge, e si trasforma così in cellula cancerosa. I particolari geni di cui parlavo si dividono in due classi, o famiglie, quella degli oncogeni e quella degli oncosoppressori. Gli oncogeni sono geni che normalmente svolgono funzioni vitali per la cellula e se sono regolari sono chiamati protoncogeni, come acceleratori della proliferazione cellulare, o da inibitori dell’apoptosi (ma non solo); se questi vengono modificati in modo da essere sempre funzionanti o non disattivabili, allora si trasformano in oncogeni, e si genera un tumore. D’altra parte, gli oncosoppressori sono quei geni che normalmente rallentano la proliferazione, inducono apoptosi, ecc.. e se vengono modificati in maniera disattivante allora, non svolgendo più la loro azione di freno, si genera un tumore.

Fino a diverso tempo fa le cure per il cancro erano aspecifiche, nel senso che avevano effetti citotossici generali, sia sulle cellule tumorali, ma anche su quelle sane; è già da alcuni anni tuttavia che si sta cercando di seguire un’altra filosofia, ovvero di creare cure e terapie mirate per i diversi tipi di cancro, e personalizzate per ogni individuo, essendo ognuno di noi diverso dall’altro; questo richiede ovviamente approfondite conoscenze che abbiamo solo in parte. Tuttavia, appunto, proprio ieri ho sentito di questa nuova possibile cura (in via di sperimentazione, sia chiaro) che si basa sul silenziamento genico indotto dall’RNA
Per silenziamento genico intendiamo quel fenomeno attraverso il quale l’informazione contenuta in un gene non viene più utilizzata, e questo silenziamento può avvenire a più livelli:

1) A livello di trascrizione: il gene non viene più letto dalla RNApolimerasi II (che è quella che sintetizza gli mRNA, quelli che saranno tradotti in proteine), e quindi non viene più prodotto l’mRNA di quel gene.

2) A livello post-trascrizionale, il gene in questione viene trascritto e produce il suo RNA corrispondente, ma questo viene in qualche modo inattivato, e quindi non si ha la traduzione in proteina.

3) A livello della traduzione: ovvero si bloccano i processi che portano l’mRNA ad essere tradotto in proteina

4) A livello post-traduzionale: in qualche modo la proteina viene inattivata prima che riesca a completare le sue finzioni.

Quindi se in qualche modo noi riusciamo a bloccare l’espressione di un gene che sappiamo essere implicato nello sviluppo di un cancro, possiamo in qualche modo aumentare le probabilità che il cancro regredisca. Come facciamo a bloccare l’espressione di un gene? Uno dei metodi possibili è quello sperimentato dai ricercatori della Sapienza, e si basa su una scoperta fatta alla fine degli anni ’90 e all’inizio del nuovo millennio che ha evidenziato il ruolo di alcuni RNA non codificanti nel silenziare un gene bloccando l’mRNA di quest’ultimo (silenziamento genico post-trascrizionale). Questi RNA silenziatori sono stati chiamati siRNA (small interference RNA) e miRNA (microRNA). Vediamone i meccanismi di azione, che sono per alcuni punti in comune.
I siRNA sono degli RNA a doppio filamento (dsRNA: double-stranded-RNA) che se presenti in una cellula portano alla distruzione selettiva degli mRNA aventi la stessa sequenza di uno dei due filamenti dell’siRNA. In maniera semplificata, il siRNA viene tagliato da una endonucleasi a RNA (un enzima che opera dei tagli sull’RNA in sequenze specifiche) che è stata chiamata Dicer. Questo frammento più piccolo di RNA si associa ad un complesso proteico RISC, che lo divide in filamenti singoli, uno dei due filamenti singoli si lega ad un mRNA che ovviamente deve essere complementare, e l’mRNA viene degradato dal complesso . Probabilmente questo sistema silenziamento indotto si deve essere evoluto per proteggere la cellula da quei Virus che hanno il loro genoma sottoforma di dsRNA; eliminando l’RNA messaggero complementare al dsRNA, si diminuiscono le probabilità che la cellula traduca proteine virali.
I miRNA invece sono degli RNA a singolo filamento (ssRNA: single-stranded-RNA) sottoforma di doppio filamento (alcune sequenze interne sono complementari tra loro e si appaiano). Derivano da dei segmenti del genoma (invece i siRNA sono esogeni), e una volta sintetizzati vengono tagliati da un’altra endonucleasi  a RNA chiamata Drosha, il prodotto della reazione viene trasportato nel citosol e da lì in poi il meccanismo è identico a quello dei loro cugini siRNA.
La terapia contemplava l’utilizzo di particolari miRNA su animali affetti da tumore alla prostata, e i risultati sono stati molto promettenti.

Lascio qui di seguito alcuni link (come sempre, se avete domande o correzioni da fare, fate pure!)

Servizio del TG

Torinoscienza

Santa Wiki

Airc

Enjoy

Forse non tutti sanno che in biologia esiste un “dogma”, chiamato appunto dogma centrale della biologia, il quale prevede che l’informaziona genica proceda sempre dal DNA alle proteine, passando per il trascritto di RNA, anche se in realtà non tutto il DNA codificante codifica per delle proteine. Questo dogma è stato mandato al diavolo dai retrovirus (piccoli ma fetenti, questi virus, eh?), ovvero virus che hanno il loro genoma sottoforma di RNA, e non di DNA, come l’arcinoto virus dell’AIDS…….questi infatti utilizzano, una volta infettata la cellula ospite, una trascrittasi inversa per formare del DNA da uno stampo a RNA (esattamente l’incontrario di una RNA polimerasi). Questo per dimostrare che nelle scienze, una volta che credi sicura una cosa, subito ti viene smontata dall’evidenza… e meno male!

Ma c’è un’altra cosa di cui vorrei parlare, e che costituisce l’argomento del mio post. Ed è un esempio di come convinzioni acquisite possano rivelarsi errate di fronte a  casi non considerati prima.
Oramai tutti, specialisti, mediamente informati e non, sappiamo come il DNA sia il depositario dell’informazione genetica, e questa serve per progettare, costruire e regolare l’organismo. L’informazione genetica è contenuta nella sequenza nucleotidica del DNA, formata dalle basi A, T, C, G.. (semmai andatevi a rivedere il mio precedente post sulla PCR per struttura del DNA). In base alla sequenza la cellula codifica una corrispondente proteina. Ebbene, Fino a qualche tempo fa si credeva indiscutibilmente che l’informazione genetica fosse contenuta soltanto nella sequenza di basi azotate. Si è invece scoperto che non è solo così, ovvero esiste tutta una serie di informazioni fondamentali alla cellula per regolare la sua espressione genica, ovvero il come e il quando vengono letti i geni che non dipendono dalla sequenza di DNA; queste informazioni dipendono infatti da modificazioni covalenti del DNA e degli Istoni, ovvero le proteine attorno alle quali il DNA si avvolge. E’ stato infatti visto come lo stato di aggregazione del DNA sia estremamente significativo: DNA estremamente avvolto (si dice superavvolto) sugli istoni è silente, nel senso che non viene trascritto in proteine, invece DNA rilassato è attivo trascrizionalmente, e la sua informazione viene così utilizzata. Lo stato di condensazione del DNA si è visto che è gran parte regolato da quelle modificazioni covalenti sovramenzionate, in particolari le più importanti e più studiate sono:

Acetilazione di residui amminoacidici degli istoni, questa aggiunta mediata dall’enzima HAT (istone acetil-transferasi) riduce la condensazione del DNA, rendendolo attivo.

Metilazione di residui amminoacidici degli istoni, mediata dall’enzima HMT (istone metil transferasi), stabilizza l’interazione DNA istone, rendendo così più difficile la trascrizione.

Metilazione del DNA, questa reazione è mediata dall’enzima DNMT (DNA metil transferasi), che metila la citosina in sequenza C-G. Questa metilazione è utile alla cellula per reprimere la trascrizione di lunghi tratti di DNA

Questo tipo di informazione si chiama epigenetica, ed è una nuova frontiera per la Biologia molecolare, perchè molte malattie, tumori in primis, sono dovute a malfunzionamenti di questo repertorio epigenetico.

Dopo così tanti post di matematica, fisica e affini è giusto far rilassare il lettore con un post sulla Biologia!

PCR è un acronimo che sta per Polymerase Chain Reaction, che per un italiano suonerebbe come reazione a catena della polimerasi. Ideata nel 1983 da un tale chiamato Kary Mullis, e questa scoperta gli è valsa il premio Nobel nel 1993, la PCR è una pratica che oramai è onnipresente negli studi concernenti la biologia, sia perchè è importantissima sia perchè è facilmente utilizzabile (tant’è che l’ho fatta anch’io nel laboratorio di biologia molecolare).
La PCR è utilizzata per amplificare ed isolare in maniera esponenziale dei segmenti di DNA in vitro, senza l’utilizzo di cellule batteriche.

Poichè in questa società CSI è tanto alla moda, non posso non evidenziare i risvolti polizieschi della PCR, poichè anche solo da una minuscola materiale biologico è possibile amplificare in maniera titanica il DNA, in modo da poterlo analizzare.
Per passare a risvolti più propriamente biologici, è molto importante nello studio della genetica:
sto facendo uno studio di genetica di popolazione, voglio vedere le differenze che intercorrono tra due popolazioni distinte della stessa specie, magari isolate tra di loro, cosa faccio? Semplice, analizzo alcune sequenze genomiche attraverso la PCR, così vedo se magari è in corso un fenomeno di speciazione.  E’ necessario analizzare sequenze genomiche sufficientemente polimorfiche per individuare le differenze; se invece voglio analizzare le parentele tra due specie differenti allora vado a studiare dei segmenti genomici più conservati, per vedere il grado di differenziazione, di solito si utilizzano i geni dell’RNA ribosomiale, che possiedono sequenze altamente conservate e sequenze molto polimorfiche. Non solo, la PCR è utilissima nell’analisi e nello studio delle malattie genetiche (Anemia falciforme, distrofia muscolare, ecc..).

Innanzitutto occorrono alcune informazioni preliminari sulla struttura del DNA. La struttura del DNA (scoperta da Watson (sì, quello che disse poco tempo fa che i neri sono meno intelligenti dei bianchi) e Crick, i quali a loro volta si sono basati su degli esperimenti fatti da Rosalind Franklin) è a doppio filamento, i quali si avvolgono in una doppia elica destrorsa. Un filamento di DNA è costituito dalla ripetizione di nucleotidi; un nucleotide è costituito da uno zucchero a 5 atomi di carbonio, il desossiribosio. Al carbonio 1 dello zucchero (chiamato 1′, si legge uno primo) si lega una base azotata (A, T, C, G) che costituisce la sola parte variabile del nucleotide, al carbonio 5′ (cinque primo) si lega un gruppo fosfato (che conferisce tra l’altro l’acidità al DNA) . Queste unità per formare un filamento si uniscono in modo che il fosfato in 5′ reagisca con il carbonio 3′ dello zucchero precedente. Quindi un filamento di DNA è formato da una successione di nucleotidi. A sua volta un filamento si accoppia ad un altro filamento per specifico appaiamento di basi: A con T e C con G (anche se non si formano legami covalenti ma solo ponti idrogeno). Ne risulta che un filamento è complementare all’altro, e data la sequenza di un filamento si può facilmente risalire alla sequenza del secondo.

Esempio: pATCGTTCTACTAAA il complementare sarà pTTTAGTAGAACGAT

Scritti così, con le informazioni che finora abbiamo non coincidono, ma non sono sbagliati; per capirlo devo però introdurre un’altra caratteristica del DNA, ovvero che i due filamenti sono detti ANTIPARALLELI ovvero che ciascun filamento è dotato di due estremità, un’estremità è quella che corrisponde al carbonio 5′ dello zucchero del primo nucleotide (a cui è legato il gruppo fofato libero, ecco perche nelle due sequenze c’è il p iniziale, indica il fosfato libero) e l’altra quella che corrisponde al carbonio 3′ dell’ultimo nucleotide. All’estremità 5′ di un filamento corrisponde l’estremità 3′ del filamento complementare, viceversa per l’estremità 3′ del filamento corrisponde la 5′ dell’altro: per convenzione un filamento singolo si rappresenta con direzionalità 5′–>3′, e così ho fatto per i due filamenti soprascritti, se ne tenete uno fermo e l’altro lo leggete al contrario sono complementari!
La PCR si basa sull’amplificazione per duplicazione dei filamenti di DNA; la tecnica ovviamente si svolge in vitro: noi abbiamo una provettina dentro la quale, tra le varie cose, inseriamo del DNA al cui interno sappiamo esserci la sequenza che vogliamo amplificare, un enzima capace di duplicare il DNA, chiamato DNA polimerasi (viene preferita una polimerasi termostabile, perchè nella tecnica viene variata la temperatura, estratta da un batterio termofilo: Thermus aquaticus), tutti e quattro i nucleotidi per dare alla polimerasi il materiale per funzionare, degli ioni per far funzionare meglio l’enzima, e poi delle sequenze singole di DNA di circa 20 nucleotidi chiamate primer. Questi primer sono complementari alle estremità 3′ della regione del DNA di interesse, questo perchè la polimerasi per ingranare ha bisogno di un innesco al quale aggiungere sequenzialmente i nucleotidi per la duplicazione. Perchè devono essere complementari all’estremità 3′ del DNA da duplicare? Perchè la polimerasi sintetizza un filamento di DNA in direzione 5′–>3′, pertanto il filamento da duplicare è visto in direzione 3′–>5′. Ora vediamo i singoli passaggi, abbiamo la provetta al completo.

1) alziamo la temperatura a 95°C per far separare i due filamenti del DNA
2) la abbassiamo successivamente a 60°C per permettere ai primer di appaiarsi ciascuno al proprio filamento complementare
3) Viene rialzata a 72°C per far funzionare la polimerasi la quale aggiunge nucleotidi ai primers in direzione 5′–>3′, copiando in questo modo il DNA d’interesse formando nuovi filamenti complementari

Si ripete per diverse volte questo ciclo fino ad amplificare ed isolare i segmenti di interesse!
Qui sotto è mostrato lo schema (lo so, l’ho fatto a mano e lascia a desiderare)

Schema grossolano della PCR

Se doveste notare errori, se voleste fare delle domande o delle precisazioni, scrivete pure nei commenti, altrimenti potete solo anche dire se vi è piaciuto oppure vi ha fatto schifo, sono accette tutte le critiche!