Biologia molecolare

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Vettori retrovirali: come e perchè

15 novembre 2011 in lente di barlow by Manuel | 2 comments

Ammetto che i retrovirus turbano la mia mente, come biologo molecolare mi sento profondamente attratto da loro (patogeni esclusi), basta vedere quanta attenzione ho loro dedicato! Sarà che ben l’8% del mio genoma in realtà è retrovirale? Ma se è per questo anche il vostro (vedere articolo precedente)!
Un vettore molecolare è un sistema per trasferire elementi genici (geni interi, frammenti di geni, elementi regolatori) in un sistema accettore compatibile. Gli esempi di vettori più semplici che abbiamo sono i plasmidi batterici, molecole di DNA circolare (che si trovano normalmente in natura come elementi extracromosomici nei batteri, appunto) all’interno delle quali possiamo inserire dei geni di nostro interesse, dopodichè non dobbiamo “far altro” che introdurre questi plasmidi “pieni” all’interno dei batteri scelti (processo detto trasformazione) e in questo modo i batteri, che faremo proliferare, produrranno numerose copie di questo plasmide e se è il caso esprimeranno anche la proteina relativa (per approfondire leggere il mio vecchio articolo cloning a gene)!
I vettori retrovirali hanno la stessa filosofia di base, ma sono decisamente più sofisticati e raffinati. Ma andiamo con ordine! Ovviamente un vettore retrovirale si basa sulla biologia dei Retrovirus di cui, come ho già detto nell’articolo precedente, ho già parlato anche fin troppo (Qui e Qui e Qui), per cui non sto a rispiegare cosa sono e cosa fanno.

Quello che spiegherò invece è la struttura del genoma retrovirale; un retrovirus ha un genoma a RNA a singolo filamento. Alle estremità di questo filamento ci sono due sequenze terminali diverse, una sequenza terminale 5′ costituita da una regione chiamata R e una regione chiamata U5, e una sequenza terminale 3′, costituita da una sequenza chiamata U3 e una copia identica della sequenza R.

R-U5_________________(RNA a singolo filamento)_______________U3-R

Queste sequenze (R-U5 e U3-R) sono estremamente importanti sia nell’integrazione del genoma virale (retrotrascritto poi in DNA), sia nell’espressione dei geni virali da parte di fattori di trascrizione dell’ospite. Durante la retrotrascrizione, il processo col quale il Genoma virale di RNA a singolo filamento viene trasformato in un genoma a DNA a doppio filamento (leggere il post Retrovirus), vengono aggiunte dei pezzettini al genoma in costruzione, e queste sequenze sono rispettivamente la sequenza U3 al 5′ (prima della sequenza R) e di U5 al 3′, (dopo la sequenza R). In questo modo, quelle che nel genoma a RNA erano sequenze terminali diverse (R+U5 vs U3+R), ora sono diventate delle sequenze terminali identiche (U3-R-U5 e U3-R-U5) Queste sequenze sono chiamate LTR, Long terminal Repeats.

U3-R-U5_____________(DNA a doppio Filamento)______________U3-R-U5

All’interno del genoma, tra queste due LTR ci sono ovviamente i geni retrovirali. I tre geni più importanti sono chiamati Gag, env e pol, che codificano ciascuno per diverse proteine. Il gene gag codifica per le proteine del capside virale, Env codifica per le proteine dell’envelope e Pol codifca per proteine come la retrotrascrittasi, l’integrasi e la proteasi.
La trascrizione di questi geni inizia una volta che il Genoma a DNA si è integrato. I trascritti possono Monocistronici (ovvero contenere un solo gene) oppure policistronici. La maturazione delle proteine virali avviene poi attraverso la proteasi che dai precursori genera le proteine definitive.
Oltre a Gag, Pol e env, ci sono anche altri geni accessori che possono variare da retrovirus a retrovirus, e hanno il compito di facilitare l’operato del virus, molto famosa è, nell’HIV, la proteina Tat, codificata dal gene omonimo, che è un trans-attivatore, ovvero è una proteina che durante la trascrizione del genoma del virus integrato, si lega al trascritto nascente e permette di aumentare l’efficienza della trascrizione stessa consentendo la produzione di trascritti full-lenght, senza questa proteina il virus sarebbe in grado di sintetizzare solo messaggeri troppo corti.

Un vettore retrovirale sfrutta la capactà dei retrovirus di INFETTARE le cellule e di INTEGRARE il loro genoma in quello delle cellule ospiti. In questo modo possiamo trasferire e far esprimere geni che vogliamo ai nostri modelli sperimentali (linee cellulari, animali) in maniera permanente e stabile. Quello che ci serve prima di tutto è quindi il genoma di un retrovirus, all’interno di questo genoma che è solitamente lungo una decina di kilobasi, dobbiamo inserire il gene di interesse. I problemi sono 2, il primo è che la somma tra il genoma retrovirale e il gene di interesse non deve superare una soglia critica, perchè altrimenti il vettore non potrà essere inserito all’interno del virus (capside) stesso per motivi di spazio. Il secondo è che non possiamo lavorare con il genoma ad RNA. Per il primo problema si è fatto sì che si sviluppassero dei vettori retrovirali estremamente ridotti, ovvero contenenti soltanto le LTR terminali ed una sequenza molto importante chiamata di incapsidamento (spiegherò dopo il significato). In questo modo, avendo eliminato tutti i geni retrovirali, io posso inserire all’interno delle LTR il mio gene di interesse. Il secondo problema è stato aggirato lavorando su vettore retrovirale in DNA. Tra tutti i vettori retrovirali, i più diffusi sono quelli lentivirali (i lentivirus sono una sottoclasse dei retrovirus)

 

 

In questo Vettore retrovirale abbiamo le due sequenze LTR, e una sequenza Psi che è la sequenza di incapsidamento. Dopodichè abbiamo due geni, uno che codifica una proteina che conferisce resistenza all’ampicillina esterno alle LTR, e un altro che codifica una proteina che conferisce resistenza ad un altro antibiotico, la neomicina che è interno alle LTR e sotto un promotore specifico SV-40 (SV-40 è un promotore appartenente ad un virus delle scimmie, ma non un retrovirus). Che cosa servono questi due geni di resistenza antibiotica? Servono per selezionare. Per iniziare, devo trovare il sistema per inserire il gene di interesse nel vettore di cui vedete sopra un’immagine (esistono tantissimi tipi di vettori retrovirali, e lentivirali in particolar modo). Il modo tradizionale consiste nell’usare degli enzimi di restrizione. Un enzima di restrizione è un enzima che taglia un doppio filamento di DNA, riconoscendo una specifica sequenza. Se io taglio il mio vettore, con un enzima che riconosca una sequenza una sola volta, e che quindi faccia un solo taglio (Per fare questo c’è una mappa di restrizione che indica i diversi siti di taglio presenti sul vettore), e in particolar modo riconosca una sequenza presente nella regione chiamata MCS, io aprirò il mio vettore, lo renderò una molecola di DNA lineare. Il taglio deve generare preferibilmente delle sticky ends, in modo che, usando lo stesso enzima per il mio gene di interesse (facendo attenzione che non lo tagli in mezzo, ma solo alle estremità), Io potrò incastrare il mio gene di interesse all’interno del mio vettore linearizzato proprio perchè avranno le estremità complementari. Legando il mio gene al mio vettore, questo si ricircolarizzerà, generando una molecola di DNA circolare con dentro il mio gene. Il gene è inoltre stato inserito in mezzo alle due LTR retrovirali (perchè ho utilizzato un enzima che tagliasse nel MCS). Ci sono inoltre dei metodi per inserire il gene nella direzione giusta, in modo che sia sotto il controllo del giusto promotore retrovirale (clonaggio direzionale).
Dopodichè si utilizzano dei batteri, all’interno dei quali inseriamo il nostro vettore per aumentarne la quantità. Solo i batteri che hanno assunto il vettore saranno in grado di crescere in un terreno contenente ampicillina, in questo modo io seleziono esclusivamente i batteri che mi servono, quelli che hanno il vettore. La domanda che potreste fare è: ma se visto che ho due geni che danno la resistenza due antibiotici diversi, uno chiaramente per i batteri e l’altro per le cellule eucarioti, sono interscambiabili? Posso cioè utilizzare la neomicina per selezionare i batteri anzichè l’ampicillina? la risposta è no, perchè in questo caso il gene della resistenza alla neomicina è sotto un promotore specifico per le cellule eucarioti, e i batteri non lo leggerebbero, per cui i batteri non sono resistenti alla neomicina, mentre le cellule eucarioti non sono sensibili all’antibiotico ampicillina per cui la selezione invertita non funzionerebbe.
Una volta ottenute grandi quantità di vettore, devo passare allo step successivo. Ovvero creare il retrovirus che contenga come genoma il mio vettore che ho appena costruito. Per fare questo devo tenere conto di diverse cose. innanzitutto, il mio vettore retrovirale, che ho appena costruito da solo non è in grado di produrre nessun virus visto che gli mancano tutti i geni (che gli sono stati tolti per far spazio al gene di mio interesse). Pertanto devo utilizzare un sistema di vicariaggio, ovvero inserire artificilamente il mio vettore appena fatto in cellule apposta (trasfezione). Queste cellule sono chiamate cellule Helper, poichè portano al loro interno tutti i geni retrovirali necessari (gag, env, pol ecc) ma senza la sequenza di incapsidamento. Quindi le cellule helper sono in grado di fornire al mio vettore le proteine neccessarie a integrarsi e trascriversi, sono in grado fabbricare le proteine strutturali virali e quindi di fabbricare il corpo del virus all’interno del quale dovrà incapsidarsi il nostro vettore di interesse. A questo punto entra in gioco il secondo fattore, ovvero la sequenza di incapsidamento: mentre il vettore che contiene il gene di mio interesse contiene la sequenza di incapsidamento, quello che fornisce le proteine retrovirali no, pertanto è impossibile che si vengano a creare dei virus contenenti il vettore con gag env e pol, ma solo quello contenente il gene che voglio. Le cellule Helper sono ottenute infettando delle cellule con un retrovirus privato della sequenza psi; con i primi protocolli accadeva che durante il processo di produzione dei retrovirus, si generassero spontaneamente dei retrovirus replicazione competenti (al contrario di quelli che si volevano ottenere, dei virus replicazione-incompetenti); questa reversione spontanea era dovuta ad eventi di ricombinazione tra il vettore col gene di mio interesse e il vettore con i geni virali standard privato della sequenza psi. Per ovviare a questo problema, si iniziò a transfettare le cellule Helper con vettori separati: uno che codifica per i geni gag-pol, ed un secondo vettore che contiene invece il gene env. Il gene env è molto importante perchè codifica per le proteine di superficie, quelle dell’envelope, che sono le proteine con cui il virus riconosce le cellule e le infetta. Il gene env quindi detrmina la specificità (tropismo) del virus nei confronti dell’ospite. Oltre a questo accorgimento si iniziarono a togliere tutte le sequenze non indispensabili dai vettori helper, per ridurre la probabilità di ricombinazione.
Quindi alla fine della fiera, io inserisco il mio vettore retrovirale nelle cellule helper, e queste cellule helper dopo alcuni giorni di incubazione mi daranno numerose particelle virali contenenti il vettore di mio interesse, anche se sulla totatilità solo una percentuale sarà effettivamente attiva (alcune particelle potranno infatti essere vuote). Io quindi prelevo dal terreno di coltura di queste celluel helper i miei virus, e posso usarlo per infettare le mie cellule. Il virus che ho ottenuto, sarà quindi come stabilito, replicazione incompetente perchè il suo genoma non è in grado di produrre le proteine virali, questo fa sì che quando utilizzerò il virus appena prodotto per infettare le cellule designate, che non sono più cellule helper, ma cellule normali, si avrà soltanto il processo di infezione, di retrotrascrizione e di integrazione del genoma virale e non si avrà nessuna produzione di virus. Ovviamente le cellule da infettare devono essere compatibili con il virus ottenuto, e la compatibilità è data, come ho detto prima, dalle proteine dell’envelope.
Quindi, lo step finale è quello di utilizzare i virus prodotti per infettare le cellule, normalmente quello che si fa è di creare sia un controllo positivo che un controllo negativo. Il controllo positivo può essere un retrovirus contenete nel suo genoma il gene della GFP, in modo che questo renda facile la quantificazione dell’efficienza di infezione (in base al numero di cellule con la fluorescenza verde). Il controllo negativo è un vettore retrovirale vuoto, senza nessun gene inserito, questo serve a controllare gli effetti dell’integrazione casuale che il genoma retrovirale subisce. Inoltre, le cellule infettate col virus vengono fatte crescere in un terreno contenente neomicina (nel caso del vettore in figura), per selezionare solo le cellule che hanno integrato il vettore. Le cellule infettate quindi esprimeranno stabilmente il gene di mio interesse, e il vantaggio di usare vettori retrovirali è che l’efficienza di infezione è molto alta, molto più alta di qualsiasi altro metodo “gene-delivering”.

Ora, per finire, vorrei parlarvi delle apllicazioni pratiche di questo sistema. A cosa mi serve creare dei retrovirus per far esprimere geni di mio interesse? Beh, senz’altro a studiare gli effetti dell’espressione di uno o più geni in un sistema controllato. Ad esempio io trovo che in un particolare tipo di tumore ricorre una particolare mutazione in un gene specifico. Per dimostrare che questa mutazione sia o meno importante nella generazione del tumore, io posso utilizzare dei vettori retrovirali per infettare cellule che non esprimono quel gene con la forma mutata e con la forma standard e osservare le differenze di comportamento nelle cellule infettate.
Un altro campo di applicazione è la cosiddetta Gene-therapy, terapia genica, ovvero il tentativo di curare malattie attraverso l’espressione di geni estranei. Famoso è il caso del deficit di adenosina deaminasi (ADA-deficiency), una malattia genetica che causa una gravissima immunodeficienza congenita. Si è provato a prelevare le cellule staminali emopoietiche di bambini malati, e infettarle con un retrovirus contenente il gene dell’enzima ADA. Straordinariamente le cellule transgeniche, una volta reimmesse nel midollo osseo dei bambini, davano origine a cellule immunitarie funzionanti, eliminando così l’immunodeficienza. Questi sono rari casi di successo nei protocolli di terapia genica attualmente in corso. bisogna sottolineare come, essendo l’integrazione del virus casuale, questo possa rappresentare un rischio di mutagenesi-virus-indotta. Altre applicazioni consistono nell’utilizzare dei vettori retrovirali per far esprimere geni come l’insulina nei diabetici (in corso di sperimentazione), o di utilizzare questi vettori come “bombe” mirate a far suicidare le cellule tumorali (introducendo geni antiproliferativi come p53), il problema è quello di riuscire a costruire dei vettori specifici soltanto per le cellule tumorali.
Concludo con una nota sulla sicurezza in laboratorio durante la produzione di questi virus. Il pericolo maggiore per i ricercatori è quello ovviamente di infettarsi con il virus prodotto, questo ovviamente è tanto più possibile quanto più compatibile è il virus con l’essere umano. Per questo è obbligatorio seguire rigide preocedure di sicurezza (lavorare in laboratori attrezzati specificamente e adibiti apposta, lavorare sempre sotto cappa, indossare mascherina e indumenti protettivi ecc, buon senso)

Spero di non avervi annoiato! Se avete domande, usate i commenti!

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Professione proofreader

27 marzo 2011 in dendrite by Manuel | No comments

Dicesi proofeader un correttore di bozze. Una persona cioè che rilegge i testi da pubblicare per individuare gli errori e correggerli. Gli errori si sa è impossibile eliminarli completamente, ma un buon correttore di bozze ne individua ed elimina la maggiorparte, rendendo i rimanenti trascurabili e il testo leggibile.
Ciò a cui voglio arrivare con questa introduzione probabilmente l’avrete già capito. Sono un tipo prevedibile, non c’è dubbio! Ciò che noi chiamiamo correttore di bozze è una perfetta analogia con la correzione degli errori a livello del DNA. Abbiamo in entrambi i casi una montagna di informazioni che deve essere preservata affinchè sia funzionale. Durante ogni processo di Replicazione del DNA (che precede ogni divisione cellulare), ma anche durante la normale vita cellulare il DNA, i nostri geni, possono subire delle alterazioni. Nel primo caso infatti, gli enzimi che sintetizzano il nuovo filamento di DNA a partire da quello vecchio, con una frequenza variabile, possono copiare in modo errato il DNA, introducendo così una mutazione. Accoppiare una A con una G, induce una mutazione. Nel secondo caso, invece, eventi esterni come l’esposizione ad agenti cancerogeni (che sono mutàgeni, ovvero inducono mutazioni) oppure interni come la liberazione di Radicali liberi, possono danneggiare o mutare il DNA. Se questi errori non fossero individuati e corretti si svilupperebbe una instabilità genomica tale che la vita degli organismi sarebbe messa seriamente a rischio. Ovviamente durante l’evoluzione si sono selezionati numerosi geni che entrano a far parte dei cosiddetti: “Sistemi di riparazione del DNA”. Questi sistemi sono costituiti da enzimi in grado di riconoscere le anomalie e nella maggiorparte dei casi di correggerle. Esistono delle patologie ereditarie in cui alcuni geni che codificano per questi enzimi sono mutati e non funzionanti. I sfortunati soggetti affetti da queste malattie hanno un genoma più instabile rispetto alle persone normali, e più soggetto a mutazioni. Tutto ciò si traduce in un marcato aumento del rischio di sviluppare tumori in giovane età (Xeroderma Pigmentoso).
Addentriamoci maggiormente nell’argomento. In maniera molto schematica, possiamo dividere i sistemi di riparazione del DNA in base al meccanismo con cui l’acido nucleico viene riparato.
Immaginamo di avere una lesione al DNA molto seria, e per lesione al DNA intendo, ad esempio, nucleotidi ai quali sono legati covalentemente dei gruppi chimici. E’ questo il caso, ad esempio, dell’esposizione ad alcuni agenti cancerogeni detti (Agenti Alchilanti, che trasferiscono sui nucletodi gruppi alchilici, modificandoli. In questo caso la via preferenziale è l’escissione dei nucleotidi alterati, attraverso il taglio del filamento danneggiato ai lati della lesione, l’eliminazione del frammento escisso e la sintesi grazie all’intervento della DNA polimerasi della regione mancante usando come stampo il filamento non danneggiato. Questo meccansimo viene definito Nucleotide Excision Repair, per gli amici NER. Si ritiene che il NER sia utilizzato nei casi in cui, durante la trascrizione di un gene, la RNA polimerasi si blocchi a causa dell’errore. In questo caso l’errore viene riconosciuto e corretto dando la precedenza ai geni che vengono trascritti rispetto a quelli che sono silenziati.
Parliamo invece di BER, ovvero Base Excision Repair, quando non si tratta di eliminare l’intero nucleotide, o sequenza di nucleotidi, come nel NER, ma soltanto la base azotata. Infatti, molte volte ad essere alterata nel DNA è proprio la base azotata (A, T, G, C). Ad esempio, spontaneamente la Citosina può convertirsi in Uracile, attraverso la perdita di un gruppo amminico. L’uracile non è una base consentita nel DNA, pertanto in questo caso il BER interviene, elimina l’uracile e, dato il fatto che l’uracile si trovava accoppiato con una guanina viene rimpiazzato con l’appropriata citosina. Deve essere questo il motivo per cui l’uracile è stato sotituito dalla Timina nel DNA, perchè c’era il pericolo della conversione spontanea della citosina. Tuttavia, bisogna sottolineare che spesso nel DNA la citosina si trova metilata sul carbonio 5, in 5 metilcitosina per ragioni epigenetiche. Queste metilazioni sono indispendabili per la regolazione della trascrizione. La deaminazione della 5 metilcitosina dà la timina, che essendo una base naturale del DNA causa possibile confusione nei sistemi di riparazione. Un’altra modificazione spontanea delle basi azotate è quella che dall’Adenina porta all’Ipoxantina, sempre attraverso la deaminazione. L’ipoxantina non è una base comune (è un intermedio metabolico) e pertanto viene riconosciuta come errata.
Altre alterazioni possono colpire le basi azotate, e venire corrette mediante il BER.
Quello che vorrei fosse chiaro però, è che non c’è una distinzione netta tra mutazioni riparabili dal NER e quelle riparabili dal BER. C’è una certa sovrapposizione che crea ridondanza. Questo ovviamente è un meccansimo di sicurezza in più, nel caso fosse danneggiato un sistema.
Poi abbiamo il cosiddetto Mismatch Repair (MMR). Ovvero riparazione degli accoppiamenti sbagliati. La DNA polimerasi, come dicevo, non è un enzima perfetto e talvolta durante il processo di duplicazione del DNA può accoppiare due nucleotidi sbagliati. Così come negli altri casi, questa alterazione viene avvertita dai sistemi di riparazione, e viene così eliminato il nucleotide errato. Benissimo. Come distinguiamo il nucleotide errato da quello corretto? Se ci troviamo di fronte una A con una G, come fa l’enzima a sapere se è la G che è stata accoppiata alla A o viceversa? A questo proposito viene in soccorso il fatto che normalmente il filamento di DNA “originale”, quello più vecchio insomma, è distinguibile da quello nuovo grazie a delle metilazioni a livello delle Adenine in particolari sequenze come GATC. Questa sequenza ha una frequenza di circa 1/256, e l’enzima che opera questa metilazione è chiamato Dam metilasi. Il filamento appena sintetizzato ci impiega un po’ di tempo prima di essere metilato, per cui c’è un intervallo di tempo nel quale i sistemi di riparazione possono distinguerlo. A volte le cose più semplici sono quelle più vincenti.
Abbiamo visto come il DNA sia una molecola soggetta a mutazioni. Queste mutazioni possono essere spontanee (come la deaminazione della citosina in uracile), indotte (come l’alchilazione delle basi azotate), oppure dovute alla replicazione. Abbiamo anche visto come numerosi enzimi riconoscano queste alterazioni e le riparino. Si stima che durante una divisione cellulare la frequenza di mutazione si aggiri attorno a 1.4E-10 per nucleotide/cellula/divisione, che è un valore virtualmente nullo.
Immaginiamo però una situazione più grave. Immaginiamo un caso in cui entrambi i filamenti della doppia elica sono danneggiati. Magari perchè sono rotti (DSB, double strand breaking). Casi simili possono essere dovuti all’esposizione di radiazioni elettromagnetiche come raggi UV o peggio, raggi gamma. In questo caso non abbiamo un filamento a cui affidarci per la riparazione. In questo caso abbiamo due vie. La prima, poco accurata e più semplice, si chiama Non Homologous End Joinnig (NHEJ), e consiste nel riunire i due filamenti rotti. Questo sistema non è molto accurato, e nel processo possono perdersi diversi nucleotidi, causando comunque mutazioni. Il secondo caso, invece, abbiamo la ricombinazione genetica. Ho già parlato diverse volte della ricombinazione. E’ un processo che avviene nei gameti, e si chiama crossing over, ma anche nelle cellule immunitarie e si chiama ricombinazione somatica. È un processo che prevede lo scambio di due o più segmenti genici. Può avvenire all’interno dello stesso cromosoma o avvenire tra due cromosomi diversi. In questo caso, in breve, si cerca di riparare al danno andando a “copiare” la stessa regione danneggiata sul rispettivo cromosoma omologo, che si spera non sia stato danneggiato anch’esso. Questo è uno dei vantaggi di essere diploidi, avere il Genoma in doppia copia!
Nel caso in cui il danno al DNA fosse irreparabile, molto probabilmente la cellula andrà incontro ad apoptosi, ovvero morte cellulare programmata. Questa è l’ultima difesa che abbiamo contro lo sviluppo di cellule mutate potenzialmente tumorali.

Spero che l’argomento sia stato interessante. Se avete domande, o notate errori usate i commenti!

Alla prossima!

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Come la Casualità gioca a nostro favore

10 febbraio 2011 in lente di barlow by Manuel | 12 comments

Finalmente sono tornato! Non ero morto nel frattempo. Il mio ultimo Post risale a più di un mese fa, è ora che io mi decida a scrivere il prossimo. Se non altro sono avvantaggiato, so già di cosa parlerà. Il mio ultimo post riguardava L’immunosorveglianza e l’immunoterapia come possibile arma nella battaglia contro il cancro. E mi era stata fatta una domanda, e ringrazio chi me l’ha fatta, riguardante il funzionamento del sistema immunitario, in particolare: “qual è l’origine della diversificazione del sistema immunitario?”. Il fulcro della discussione sarà incentrato quindi sulle cellule dell’immunità specifica:
I Linfociti B e i Linfociti T. Essi provengono da uno stesso precursore staminale, chiamato precursore Linfoide, che attraverso delle divisioni cellulari, darà origine a delle cellule che man mano si differenzieranno o in B o in T.
I Linfociti B ricordo che sono le cellule che producono gli anticorpi, mentre i Linfociti T hanno molte funzioni, tra cui regolare la risposta immunitaria, riconoscere cellule infette ed eliminarle, ecc…
I primi completano il loro differenziamento nel midollo osseo (B sta per Bone marrow, midollo osseo appunto) i secondi nel Timo. All’inizio quindi, non c’è differenza, poi man mano che i cloni si differenziano, prendono una strada piuttosto che un’altra. Ovviamente, come potrete capire, si tratta di un aut aut.
Durante il processo di maturazione verranno espressi i geni che codificano per il recettore dei linfociti B (BCR) e il recettore dei linfociti T (TCR). Questi due recettori sono i responsabili della specificità e della diversificazione del sistema immunitario. Ciascun recettore di ciascun linfocita è specifico per uno e uno solo antigene, e questa specificità è dovuta alla diversità del sito di legame del recettore con l’antigene.
A questo punto sorge spontanea una domanda. Se i geni del recettore per l’antigene sono uguali per ogni clone linfocitario di un organismo, come si genera questa diversità recettoriale? Qui entra in gioco un processo fondamentale, che pochissimi tipi cellulari sono in grado di eseguire,la Ricombinazione Genetica. Ho già scritto un post in merito alla ricombinazione: Knok Out. Ne cito alcuni passaggi per rinfrescare la memoria.

“È un processo che prevede lo scambio di due o più segmenti genici. Può avvenire all’interno dello stesso cromosoma o avvenire tra due cromosomi diversi. La ricombinazione è uno dei meccanismi attraverso il quale si forma la variabilità genetica. Uno dei più importanti eventi di ricombinazione avviene durante la meiosi (quando cioè i progenitori delle cellule germinali si dividono dando origine ai gameti); in questo caso viene anche chiamata crossing over ed è il meccanismo con il quale segmenti di DNA vengono scambiati tra due cromosomi omologhi. Questo è per creare gameti con un genotipo diverso da quello delle cellule di partenza.”

Oltre al crossing over, che avviene nei gameti, abbiamo la ricombinazione somatica che avviene nei linfociti. (somatica perché avviene in cellule somatiche e non germinali). Il meccanismo di base è lo stesso, cambia ovviamente il soggetto e il risultato. (tra l’altro, sempre nel post Knock out, spiego come è possibile usando la ricombinazione ottenere delle mappe cromosomiche dei geni, se vi interessa.. mi faccio anche la pubblicità).
Prendiamo come esempio il BCR. Il BCR è un recettore che appartiene alla famiglia delle Immunoglobuline, ovvero degli anticorpi. Anzi, esso stesso è un anticorpo, e la sua funzione è la stessa, ma a differenza di un anticorpo non viene liberato all’esterno, ma rimane fissato alla membrana cellulare. Quindi alla fine, gli anticorpi vengono sintetizzati a partire dagli stessi geni utilizzati per il recettore.
Per spiegare l’organizzazione dei geni del BCR, indispensabile per capire la ricombinazione somatica, faccio il percorso inverso, parto dalla proteina e arrivo al gene.
Come è fatto un BCR, e quindi un anticorpo? Sono delle proteine multimeriche, formate da più subunità proteiche, ciascuna codificata dal proprio gene. In particolare, sono costituiti da due catene proteiche pesanti, identiche tra loro associate. Ciascuna catena proteica pesante è a sua volta associata con una catena più leggera. In totale due catene pesanti, identiche, e due catene leggere, identiche. Sia le catene pesanti che quelle leggere sono divisibili in due sottoregioni, una variabile, ed una costante. L’associazione delle regioni variabili delle catene pesanti con quelle leggere formano la tasca di legame con l’antigene. Ciascun anticorpo avrà quindi due siti di legame identici per l’antigene perchè ci sono due coppie di catene pesanti e leggere. Per farvi un’idea potete dare un’occhiata a questo Link , che vi mostra, oltre alla struttura quaternaria della proteina (la prima immagine), anche uno schema più comprenibile della struttura dell’anticorpo.
Gli anticorpi possono inoltre essere di classi diverse (le classi si chiamano isotipi), ciascun isotipo si differenzia dall’altro per la porzione costante delle catene pesanti. Pertanto esistono gli anticorpi di classe A, D, E, G e M. Anche le catene leggere hanno due classi, K e λ. Tutto questo è molto mnemonico, ma necessario. Adesso arriva la parte divertente.
Esistono un gene che codifica per la catena K, uno per quella λ mentre tutte le catene pesanti sono codificate da un unico gene, o locus. Ciascuno di questi geni ha tre regioni, chiamate in ordine V, J e C. Il gene delle catene pesanti ha anche la regione D. Ciascuna regione, in ordine V, D, J e C contiene a sua volta delle sotto regioni, separate da DNA non codificante. Ad esempio il gene K leggo che ha circa 35 regioni V. Ciascun tratto V è diverso da tutti gli altri. Le regioni V(D) e J vanno a costituire la regione variabili delle catene, mentre la regione C quella costante.
La ricombinazione somatica cosa fa? Attraverso due enzimi RAG1 e RAG2 i cui geni vengono espressi solo durante la maturazione linfocitaria, vengono congiunte casualmente una regione V, una regione D ed una regione J, eliminando le sequenze interposte. Viene a crearsi una regione VDJ (o VJ per le catene leggere), che è praticamente unica nel suo genere, perché ottenuta mediante l’unione casuale dei segmenti genici V, D e J. Ci sono delle sequenze di riconoscimento per evitare che si giustappongano sequenze sbagliate. Inoltre la ricombinazione avviene soltanto su uno dei due alleli per ogni gene, in modo da evitare la sintesi di due recettori diversi. E se, ad esempio, viene ricombinato il gene λ, il gene K viene represso per evitare la sintesi di due catene leggere diverse.
Mentre per le catene leggere il discorso finisce qua, per le catene pesanti c’è ancora il discorso dell’isotipo. Il segmento genico unito VDJ viene trascritto dalla RNA polimerasi II in un RNA messaggero fino alle regioni C più prossimali. Abbiamo detto che la regione costante determina l’isotipo. Le regioni ci più prossimali sono quella M e quella D, quindi il primo isotipo che viene sintetizzato è di classe M o di classe D. entrambi gli isotipi possono venire espressi da una stessa cellula Avremo quindi una proteina formata da due catene pesanti identiche ricombinate, e da due catene leggere ricombinate anch’esse, o K o λ.
Tutti i Linfociti B, all’inizio, esprimono recettori di classe M e/o D sulla loro membrana. Quando una cellula B matura incontra per la prima volta il suo antigene specifico si attiva, e lo scopo dell’attivazione è quello di produrre anticorpi, che come ho detto, sono identici al BCR, solo che non sono inseriti nella membrana cellulare ma vengono rilasciati all’esterno. Durante l’attivazione il clone B va incontro a divisioni cellulari che porteranno alla formazione di due tipi di cellule: i cloni memoria e le plasmacellule. I primi rimangono silenti nell’organismo fino ad un successivo contatto con l’antigene, nel qual caso si riattivano e iniziano una nuova risposta immunitaria; le seconde hanno una vita limitata durante la quale producono grandi quantità di anticorpi. Durante l’attivazione è possibile che le plasmacellule vadano incontro allo scambio dell’isotipo della catena pesante, ovvero, attraverso un secondo evento di ricombinazione che porta alla congiunzione del segmento VDJ già ricombinato con un segmento C diverso da M o da D (A, E o G), eliminando tutto il segmento di DNA tra VDJ e il segmento C prescelto. Per cui, avremo una catena pesante che ha la stessa specificità per l’antigene, ma un diverso isotipo e quindi diverse proprietà. Una volta effettuato lo scambio dell’isotipo, quella plasmacellula non potrà più cambiarlo, e continuerà a sintetizzare anticorpi di quell’isotipo. Siccome le plasmacellule saranno molte, ci saranno scambi di isotipi diversi, e quindi avremo contro uno stesso antigene anticorpi con isotipi diversi.
Un discorso Analogo, anche se leggermente diverso vale per il recettore dei Linfociti T. Riassumo quindi i diversi processi che portano alla diversificazione dei BCR, e in modo analogo dei TCR:
1) Diversità combinatoria: La ricombinazione di n segmenti V, m segmenti D e x segmenti J in modo del tutto casuale.
2) Giustapposizione di un qualsiasi VDJ della catena pesante ed un qualsiasi VJ di una catena leggera
3) Non paghi di questo, durante la ricombinazione possiamo avere a livello delle giunzioni tra segmento V e il segmento D, e tra quest’ultimo e il segmento J l’aggiunta o la perdita casuale di alcuni nucleotidi. Cosicché se anche due BCR avessero lo stesso segmento VDJ non sarebbero comunque uguali.

La sintesi del BCR e del TCR è un processo centrale della maturazione linfocitaria. Se un clone non dovesse riuscire ad esprimere il suo recettore andrebbe incontro all’ Apoptosi. Inoltre, poichè le combinazioni sono casuali, possono uscire fuori delle combinazioni difettose, nel qual caso la cellula verrebbe comunque destinata all’apoptosi così come se il recettore risultasse specifico ad un antigene del self, in modo da evitare che il sistema immunitario si attivi contro l’organismo stesso (Tolleranza).

So che è stato un post lungo, difficile e magari anche noioso, ma spero di essere riuscito a trasmettere l’incredibile raffinatezza e complicatezza del processo. Se avete domande o se notate errori usate i commenti!

Alla prossima!

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Fattori di trascrizione e Promotori, un sistema chiave/serratura

24 ottobre 2010 in lente di barlow by Manuel | 1 comment

Era decisamente ora che scrivessi qualcosa. Ammetto che scegliere l’argomento è stato quantomeno complicato. Da una parte c’era la famosa sperimentazione made in Italy di un vaccino contro l’HIV, dall’altra avevo in serbo alcuni argomenti di Biologia molecolare. Ovviamente ho scelto la Biologia Molecolare! E’ un argomento abbastanza vago e vasto, lo ammetto, però interessante.
I famosi Promotori. Famosi forse per chi li studia, ma un po’ meno noti per chi invece non è di questo campo.  I promotori sono delle sequenze di DNA non codificante che però hanno una funzione precisa: regolare la trascrizione dei geni che controllano. Di solito i promotori sono sequenze immediatamente a monte del TSS (transcription Start Site o Sito di Inizio della Trascrizione) del gene, mentre tutte le sequenze promotrici situate più distalmente (anche migliaia di basi) dal TSS sono chiamate enhancer.
Regolano la trascrizione e quindi l’espressione genica della cellula. In che modo dunque? Abbiamo detto che sono delle sequenze. Queste sequenze sono riconosciute e legate da particolari proteine chiamate fattori di trascrizione. In maniera un po’ semplicistica possiamo dire che questi fattori di trascrizione stabilizzano il legame della RNA polimerasi, che è l’enzima, o meglio il complesso enzimatico, che è responsabile della sintesi dell’RNA messaggero usando come stampo uno dei due filamenti del DNA.
I promotori sono sempre stati eccessivamente semplificati. Per numerose decadi si pensava fossero delle sequenze precise e ben conservate alle quali si davano nomi diversi, ad esempio la TATA box era una di queste sequenze (ricca in T ed in A) situata circa 30 paia di basi dal TSS. Questi tipi di promotori sono quelli che ora vengono chiamati Textbook Promoters, promotori da libro di testo, perchè sono il modello di promotore che ancora adesso, nei corsi di primo livello, vengono insegnati. Non è che non esistano. Esistono eccome, però sono soltanto una piccola parte di questo immenso mare di sequenze. Come al solito la situazione è sempre più complessa di quanto la si possa spiegare.
L’isolamento e l’identificazione dei promotori è tuttora una grande sfida. Quasi un anno fa è uscito un articolo, su Genome Research, che pubblicava i risultati di una lunga ricerca proprio in questo campo: “Direct isolation and identification of promoters in the human genome”. Qual’è stato il loro metodo? In pratica sono andati a cercare tutte quelle sequenze genomiche in  cui era presente il complesso della RNApolimerasi ancora inattiva (che doveva cioè ancora iniziare la trascrizione) usando un anticorpo diretto contro l’RNApolimerasi. L’anticorpo si lega alla RNApol che a sua volta è legata alla sua sequenza di DNA la quale viene poi identificata ed annotata. Questo metodo viene chiamata ChIP ovvero Chromatine immuno-precipitation (mi rendo conto che è un po’ riduttivo spiegata in questo modo; chi volesse spaerne di più chieda pure). L’esperimento è stato condotto in triplice copia, in modo da ottenere una media dei risultati. La stragrande maggioranza delle sequenze trovate localizza nelle vicinanze del TSS del gene o comunque in una regione di 2.5 Kb.
Non per tutte le sequenze è stato possibile trovare una evidenza bioinformatica. Per queste sequenze è stato condotto un test sperimentale associandole a dei geni la cui espressione può essere monitorata facilmente (geni reporter) ad esempio la GFP. In questo modo è stato possibile dimostrare che molte di queste sequenze erano degli effettivi promotori perchè permettevano l’espressione del gene reporter. Quelle sequenze che nemmeno in questo modo sono risultate essere dei promotori, molto probabilmente sono dei falsi positivi.
In questo modo sono stati identificati diversi promotori che prima non si conoscevano.
Dicevo poco fa che i promotori del modello TATAbox sono riduttivi. Qual’è quindi il nuovo modello di promotore che ha soppiantato quello vecchio? Nella stragrande maggioranza dei casi (una stima dell’82%) i promotori sono cosiddetti CG rich. Ovvero non hanno una sequenza definita, ma sono molto ricchi (statisticamente più della media) di CG e sono estremamente più variabili. Sono chiamati Broad spectrum promoters poichè al contrario dei promotori TATAbox non fanno partire la trascrizione da un TSS singolo. ovvero I geni che sono sotto questi promotori sono trascritti a partite da TSS diversi. Gli RNAmessaggeri derivanti avranno quindi un sito di inizio differente (il che non vuol dire necessariamente che la proteina codificante sarà poi diversa, perchè un conto è il Sito di Inizio della Tracrizione, un altro conto è il Sito di Inizio della Traduzione: tra i due c’è una regione chiamata 5′-UTR). Questo ha un suo senso. Nel post sull’evoluzione del concetto di gene che ho scritto qualche mese fa ho detto che attualmente si stima che la maggiorparte dei geni possono essere letti in maniera differente dando origine a prodotti diversi. Variare il sito di inizo è una delle vie per rendere possibile ciò.
Questi promotori possono anche essere bidirezionali, ovvero dare origine a trascritti a partire da entrambi i filamenti del DNA nelle due opposte direzioni.
Ora che abbiamo un’idea sulla complessità dei promotori, possiamo addentrarci sulla loro funzione.
Abbiamo detto che su questi promotori si legano delle proteine, i fattori di trascrizione. Ad oggi sono stati identificati circa 1400 diversi tipi di fattori di trascrizione, molti dei quali sono tessuto specifici. Hanno dei domini che legano sequenze di DNA. Legandosi a queste sequenze innescano un meccanismo di Reclutamento di altre proteine le quali attivamente modificano lo stato degli istoni attraverso acetilazioni/deacetilazioni, metilazioni/demetilazioni e altre modificazioni covalenti. La modificazione degli istoni rende possibile o impossibile alla RNApolimerasi di di legarsi al DNA regolandone lo stato di avvolgimento e superavvolgimento sugli Istoni.  Attraverso quindi modificazioni epigenetiche si rende possibile o meno l’espressione genica. Sono stati fatti dei lavori, uno in particolare molto bello, sul reclutamento di proteine modificatrici della cromatina a livello dei siti di legame di alcuni fattori di trascrizione, in particolare il recettore per gli estrogeni. Attraverso studi di chromatine immune precipitation si è visto che nella maggiorparte dei casi il reclutamento segue dei cicli temporali predefiniti e discreti, e non è quindi un processo continuo.  C’è quindi anche un aspetto temporale e spaziale da definire. Questo rende la faccenda molto intrigante.
Concludo con una considerazione. I fattori di trascrizione regolano l’equilibrio vitale di una cellula. Ognuna delle cellule di un tessuto esprime un suo pattern di fattori di trascrizone, che non è detto che sia identico per ogni cellula di quel tessuto. C’è anche da tener conto dell’identità specifica di ogni cellula. Modificazioni dell’attività dei fattori di trascrizione possono portare allo svliluppo di neoplasie per motivi evidenti. E’ noto il ruolo dei fattori di trascrizione noti come recettori degli estrogeni nello sviluppo del cancro alla mammella. Il Tamoxifen è un farmaco storico che inibisce questi fattori di trascrizione ottenendo dei buoni risultati!

Con questo è tutto, alla prossima.

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