L’elettroforesi è una tecnica basilare non solo della biologia, ma anche della diagnostica in generale. Trova un sacco di applicazioni dovute alla sua versatilità. Le elettroforesi più comunemente utilizzate solo le elettroforesi su Gel e si basano sulla capacità delle molecole biologiche di migrare in un campo elettrico. Questa capacità è dovuta dal fatto che la macromolecola biologica possiede una carica elettrica totale, positiva o negativa, e quindi, se posta in un campo elettrico, migrerà verso l’elettrodo di carica opposta.  Questa capacità di far migrare una carica in un campo elettrico può essere sfruttata per separare  le nostre molecole in base al loro rapporto z/m dove z solitamente simboleggia la carica e m, ovviamente, la massa, (anche se, parlando di molecole, dovrebbe essere Mw: molecoular weight e misurarsi non in grammi ma in dalton, ma alla fine è il concetto ad interessarci).
Le molecole che di solito vengono separate in elettroforesi sono solitamente gli acidi nucleici (DNA, RNA) e le proteine. essendo due classi di molecole diverse, meritano attenzioni distinte. Ora passiamo ad illustrare la tecnica in generale.

Come facciamo a preparare un’elettroforesi? Abbiamo bisogno di un gel, un supporto, generalmente di plastica, in cui inserire il gel e in cui attaccare gli elettrodi, un generatore di voltaggio, e una soluzione tampone, che serve a formare il contatto elettrico tra gli elettrodi e il gel (in pratica favorisce il flusso delle cariche). Esistono due tipi di gel: i gel di agarosio e i gel di poliacrilammide; L’agarosio è un derivato polisaccaridico di alcuni tipi di alghe, mentre l’acrilammide, che è il monomero che costituisce, appunto, le molecole di poliacrilammide, è una neurotossina e pertanto, durante la preparazione, questo gel va trattato con attenzione. Sin da ora vi dico che, qualora trovaste la sigla AGE, questa sta per: Agarose Gel Electrophoresis, mentre la sigla PAGE sta per:PolyacrylAmide gel Electrophoresis.
L’ultrastruttura di questi gel è costituita da pori, i quali permettono la migrazione delle molecole. Le dimesioni dei pori sono controllabili dall’operatore in base alla percentuale di Agarosio e di Acrilammide. Più i pori sono larghi, più facilmente le molecole migreranno, più sono stretti, e più, ovviamente, incontraranno resistenza.
Quando si prepara il gel, solitamente lo si allestisce diluendo l’agar o l’acrilammide in un tampone a temperature elevate (di solito si utilizza un microonde) e pertanto, inizialmente, il gel sarà liquido. Soltanto quando si raffredderà assumerà la tipica consistenza gelatinosa. Durante il raffreddamento, si inserisce alla sommità del gel un pettine (non quello per i capelli, ma la struttura è simile), i cui dentelli formeranno, nel futuro gel, dei pozzetti dentro ai quali si inseriranno i campioni da far correre.

il gel così formato verrà inserito nel supporto di plastica, i campioni verranno caricati nei rispettivi pozzetti (questa è una operazione che è divertente quanto stressante da eseguire, perchè è piuttosto difficile vedere i pozzetti trasparenti su un gel trasparente anch’esso; è perciò piuttosto facile rompere i pozzetti, oppure non centrarli e quindi riversare il campione al di fuori. Ci vuole solo un po’ di manualità, e ricorrere a qualche trucco, come mettere uno striscio di carta colorata sotto al gel in modo da far risaltare i pozzetti). Si ricopre il gel di soluzione tampone, si attaccano gli elettrodi (facendo attenzione e non invertirli), si aziona il generatore di voltaggio (generalmente 80V per 30 minuti) e si attende. quindi si preleva il gel e si mettono in evidenza le bande così ottenute. Generalmente, uno dei classici metodi per mettere in evidenza il DNA si basa sull’utilizzo di agenti intercalanti come l’etidio bromuro o il propidio ioduro che se eccitati con UV sono fluorescenti. Siccome però questi sono agenti cancerogeni molto pericolosi, ora si utilizzano altri agenti (SYBR GREEN).. anche se noi in laboratorio abbiamo usato il bromuro di etidio, ma lasciamo perdere. Per quanto riguarda le proteine, invece, si utilizzano altri coloranti, come il blue comassie. Più o meno, ecco come si presenta il tutto:

legenda:

Well: pozzetto
Buffer: Tampone
SDS-PAGE: Elettroforesi in Gel di PoliacrilAmmide con Sodio Dodecil Solfato (vedremo dopo cos’è questo componente)

Quest’immagine mostra chiaramente come le molecole grandi corrano di meno nel gel rispetto a quelle piccole. in questo caso sono mostrate proteine.

Ora due considerazioni di carattere tecnico. La prima riguarda il fatto che, come potete vedere nella figura, i pozzetti con i campioni da far correre sono in alto, o comunque ad un marigine del gel. Questo significa che dovremo fare attenzione a come posizioneremo gli elettrodi per far sì che i campioni corrano verso basso e non verso alto. se ho del DNA, questo avrà carica negativa; tenderà a spostarsi verso l’elettrodo positivo (l’anodo), che andrà pozionato quindi dalla parte opposta dei pozzetti. se noi lo posizonassimo sullo stesso lato, non otterremo nessuna corsa perchè lo spazio è troppo breve.
La seconda riguarda invece la preparazione dei campioni per la corsa. Ho detto all’inizio che la corsa elettroforetica sarà influenzata dal rapporto z/m. Ma dobbiamo tener conto anche di un altro fattore, ovvero la forma del campione, dove per forma intendo la struttura. Come sappiamo, sia gli acidi nucleici che le proteine hanno delle conformzioni piuttosto complesse, queste influenzano significativamente la corsa di un campione. Pertanto spesso si aggiungono dei denaturanti in modo da standardizzare la situazione. In più va detto che poichè le proteine possono avere carica variabile (gli amminoacidi hanno cariche diverse) si utilizza durante la corsa un agente che oltre a denaturarle, conferisce loro una omogenea carica negativa, in modo che la corsa avvenga solo in base alla MW, questo agente è l’SDS (sodio dodecil solfato).

Alla fine, dopo tutta questa tiritera, avrete un risultato simile:

In questo gel sono presenti due set di campioni  separai (DNA), uno superiore e uno inferiore.

le due strisce laterali di sinistra, quella superioe e qualla inferiore sono costituite da campioni standard di Mw note. Facendo quindi un confronto con queste bande, si può risalire al peso molecolare dei nostri campioni. Per una determinazione più precisa è possibile ricorrere alla seguente formula:

Rf= (Distanza migrazione del campione)/(distanza migrazione del colorante)

l’Rf è la mobilità elettroforetica; la distanza di migrazione del campione è la distanza percorsa dalla banda specifica dal pozzetto. Mentre la distanza del colorante è la distanza percorsa dal fronte del colorante. C’è una correlazione lineare tra l’Rf e il LogMw; si costruisce quindi una retta di taratura tra l’Rf e il LogMW dei campioni noti. Calcolando poi l’Rf dei nostri campioni da determinare, è facile risalire (grazie all’equazione della retta trovata) alla massa molecolare.

Ora vediamo un po’ di applicazioni pratiche: immaginamo di aver appena eseguito una PCR (per vedere cos’è in brevis una PCR potetevi leggervi un mio vecchio Post), e di voler vedere se abbiamo amplificato il frammento di DNA corretto, e se ci sono rumori di fondo (ovvero frammenti di DNA che si sono amplificati pur non essendo specifici ai primer). Io so (o in teoria dovrei sapere) le dimensioni  e la massa del mio frammento di DNA amplificato, e posso pertanto prelevare un’aliquota del mio campione, fare una corsa elettroforetica su un gel e vedere se si evidenzia  su questo gel una banda corrispondente al peso molecolare noto. Se la banda è nitida avremo avuto una amplificazione specifica, se invece vedremo sbavature, avremo ottenuto un’amplificazione indesiderata. Questo potrebbe farci indurre a ripetere l’esperimento.
L’elettroforesi è anche usata per la determinazione delle proteine presenti nel plasma (anzi, per meglio dire, nel siero) come ad esempio le immunoglobuline, le albumine, ecc…
Alcune tecniche di sequenziamento del DNA si basano sull’unione della PCR con l’elettroforesi. Insomma, l’elettroforesi è uno strumento estremamente utile e anche piuttosto semplice che è oramai insostituibile.

vi do un link molto molto bello, con molte immagini che vi illustreranno meglio il concetto:

Scienze a scuola

Per ultima cosa, è mio dovere aggiungere che esistono ovviamente diversi altri tipi di elettroforesi, come L’elettroforesi bidimensionale, e l’elttroforesi in campo pulsato, e che questo che ho appena spiegato è quello di base.

Come sempre, se avete dubbi, curiosità, domande, obiezioni, io sono qui. Ciau!

Le proteine sono una delle quattro famiglie di macromolecole fondamentali per il nostro organismo, assieme ai carboidrati, ai lipidi e agli acidi nucleici (DNA e RNA). Una buona parte della biochimica è rivolta allo studio delle proteine che svolgono una quantità di funzioni immensa.
Le proteine sono macromolecole costituite da una sequenza definita di L-amminoacidi, legati uno all’altro con un legame carbamidico (o peptidico). Una volta sintetizzate, le proteine assumono una struttura tridimensionale specifica (attraverso un processo di folding, alias ripiegamento), perchè la loro funzione è intimamente associata alla loro struttura, se la struttura è difettosa, risulterà tale anche la funzione, numerose malattie sono dovute ad un errato ripiegamento delle proteine (anemia falciforme, BSE, ecc..).
Esistono diversi gradi di struttura per una proteina; la semplice sequenza lineare degli amminoacidi è detta struttura primaria; non discuterò qui la struttura e la geometria del legame peptidico, basti sapere che è un legame estremamente rigido che non permette la rotazione, ruotano però i due legami contigui ad esso il Cα-COOH e il NH-Cα e dalla rotazione di questi legami vengono formati due angoli, rispettivamente Ψ (Psi) e Φ (phi); questi due angoli teoricamente possono variare da -180° a + 180°, anche se in pratica alcuni di questi valori sono proibiti per delle interferenze che si possono venire a creare tra le catene laterali degli amminoacidi. I valori ammessi di questi angoli possono venire riportati su un grafico in cui un psi viene studiato al in funzione di phi, questo grafico è detto grafico di Ramachandran (Ramachandran’s plot).
In Base agli amminoacidi e agli angoli il polipeptide (la sequenza di diversi amminoacidi) può assumere conformazioni più complesse, che vengono definite strutture secondarie. Le più comuni strutture secondarie sono α-elica e il β-foglietto (oβ-sheet):

-α elica: è un’elica destrorsa formata dall’avvolgimento attorno ad un asse centrale immaginario del polipeptide. In questa elica le catene laterali degli amminoacidi sono proiettate all’esterno. L’alfa Elica ha un’unità ripetitiva di 5.4 angstrom, ed è stabilizzata al suo interno da interazioni non covalenti; anche se non è l’unica struttura elicoidale esistente nel mondo proteico, l’alfa elica è senz’altro la più comune. E’ molto frequente nelle proteine fibrose come la cheratina o il collagene.

- β-foglietto: è una struttura più estesa e si forma quando due o più segmenti del polipetide si trovano ad essere paralleli (non dovete però immaginarli staccati, ma in continuità…un oggetto che ci si avvicina è una serpentina). nel Beta foglietto ogni segmento che lo compone ha un andamento a zig-zag e le catene laterali sono alternativamente proiettate al di sopra e al di sotto del piano formato dal foglietto. La struttura è stabilizzata da legami non covalenti al proprio interno. Possono esserci due tipi di β-foglietto: parallelo o antiparallelo a seconda della direzionalità dei segmenti che lo compongono. Generalmente l’antiparallelo è più stabile.

Sono poi stati studiati dei segmenti all’interno della struttura proteica che collegano le estremità di due segmenti o in conformazione  alfa o in conformazione beta, e sono chiamati ripiegamenti beta o β-turns.
Poichè abbiamo detto che a seconda degli amminoacidi presenti possiamo avere o una o l’altra conformazione, in un polipeptide sufficientemente lungo e vario nella sequenza potremmo avere, e difatti abbiamo, regioni con una conformazione e regioni con un’altra. Un ulteriore ripiegamento nello spazio
del polipeptide con queste conformazioni secondarie porta ad una conformazione tridimensionale (struttura terziaria) in cui diverse regioni, magari prima anche distanti, interagiscono tra di loro per dare una struttura compatta e funzionale alla proteina. Se la proteina in questione è un enzima verrà formato il sito attivo funzionale e specifico, e, se è previsto, anche la tasca dove si inserirà il cofattore; se invece è un recettore si formerà il sito di legame con il ligando etc. In base al tipo di ripiegamento vengono distinte proteinde fibrose e proteine globulari; le prime, come collagene e cheratina, hanno una struttura adatta a ricoprire ruoli strutturali, mentre le seconde, come le globuline, hanno una struttura più globosa e compatta delle prime e di solito non hanno ruoli strutturali.
Se immaginiamo di avere diverse catene polipeptidiche legate non covalentemente, ognuna con la sua struttura e il suo ripiegamento, abbiamo una struttura quaternaria. Alcune proteine infatti sono formate da più subunità polipeptidiche associate non covalentemente, e le interazioni tra le varie parti possono influenzare le proprietà e le funzioni della proteina. L’esempio più famoso che mi viene in mente è l’emoglobina, la proteina responsabile del trasporto di ossigeno negli eritrociti. Essa è costituita da quattro subunità, a due a due identiche: 2 α e 2 β (non c’entra con l’α-elica e il β-foglietto..) per un totale di 64500Dalton; ciascuna di queste subunità contiene in appositi siti un gruppo eme, una molecola non proteica responsabile del legame e del trasporto dell’ossigeno.
Torno a sottolineare l’importanza di un corretto ripegamento tridimensionale per la proteina, perchè se questo è errato o viene successivamente perso viene a determinarsi  anche la perdita della funzione. Supponiamo ora di avere una proteina di piccole dimensioni, circa 100 amminoacidi, e supponiamo che ciascun amminoacido abbia in media la possibilità di trovarsi in 10 conformazioni diverse: la proteina avrà qualcosa come 10 alla centesima diverse possibili conformazioni. Anche ammettendo che la proteina ne provi casualmente ciascuna in 10^-13 secondi, per esplorarle tutte ci impiegherebbe circa 10^77 anni…e dato che l’universo ha circa 14 miliardi di anni, è impossibile che le proteine trovino casualmente la loro conformazione nativa. Questo problema prende il nome di paradosso di Levinthal.
I processi di ripiegamento non sono ancora completamente noti, ma ci sono delle teorie plausibili; una di queste prevede che i vari amminoacidi, guidati dalle interazioni, idrofobiche, polari o steriche, tra le loro catene laterali, si dispongano localmente ad alfa elica o a foglietto beta, questo cambia la conformazione del polipeptide e porta regioni prima lontane ad interagire e ad assumere nuove conformazioni, fino al completamento della struttura.
Cosa spinge però la proteina a ripiegarsi? è un processo spontaneo oppure dato da un dispendio di Energia? La risposta non è univoca, perchè alcune proteine si ripegano spontaneamente grazie alle interazioni degli amminoacidi tra di loro e con l’ambiente esterno, pertanto gli amminoacidi idrofobici verranno automaticamente posizionati il più lontano possibile dall’acqua (abbondante nel mezzo esterno), mentre verranno allontanati quelli con cariche dello stesso segno. Altre proteine hanno un ripegamento “guidato” e “assistito” da altre proteine, dette chaperonine (leggere “Sciaperonine”, perchè deriva da un termine francese), che utilizzano ATP per svolgere le loro funzioni.