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Vettori retrovirali: come e perchè

15 novembre 2011 in lente di barlow by Manuel | 2 comments

Ammetto che i retrovirus turbano la mia mente, come biologo molecolare mi sento profondamente attratto da loro (patogeni esclusi), basta vedere quanta attenzione ho loro dedicato! Sarà che ben l’8% del mio genoma in realtà è retrovirale? Ma se è per questo anche il vostro (vedere articolo precedente)!
Un vettore molecolare è un sistema per trasferire elementi genici (geni interi, frammenti di geni, elementi regolatori) in un sistema accettore compatibile. Gli esempi di vettori più semplici che abbiamo sono i plasmidi batterici, molecole di DNA circolare (che si trovano normalmente in natura come elementi extracromosomici nei batteri, appunto) all’interno delle quali possiamo inserire dei geni di nostro interesse, dopodichè non dobbiamo “far altro” che introdurre questi plasmidi “pieni” all’interno dei batteri scelti (processo detto trasformazione) e in questo modo i batteri, che faremo proliferare, produrranno numerose copie di questo plasmide e se è il caso esprimeranno anche la proteina relativa (per approfondire leggere il mio vecchio articolo cloning a gene)!
I vettori retrovirali hanno la stessa filosofia di base, ma sono decisamente più sofisticati e raffinati. Ma andiamo con ordine! Ovviamente un vettore retrovirale si basa sulla biologia dei Retrovirus di cui, come ho già detto nell’articolo precedente, ho già parlato anche fin troppo (Qui e Qui e Qui), per cui non sto a rispiegare cosa sono e cosa fanno.

Quello che spiegherò invece è la struttura del genoma retrovirale; un retrovirus ha un genoma a RNA a singolo filamento. Alle estremità di questo filamento ci sono due sequenze terminali diverse, una sequenza terminale 5′ costituita da una regione chiamata R e una regione chiamata U5, e una sequenza terminale 3′, costituita da una sequenza chiamata U3 e una copia identica della sequenza R.

R-U5_________________(RNA a singolo filamento)_______________U3-R

Queste sequenze (R-U5 e U3-R) sono estremamente importanti sia nell’integrazione del genoma virale (retrotrascritto poi in DNA), sia nell’espressione dei geni virali da parte di fattori di trascrizione dell’ospite. Durante la retrotrascrizione, il processo col quale il Genoma virale di RNA a singolo filamento viene trasformato in un genoma a DNA a doppio filamento (leggere il post Retrovirus), vengono aggiunte dei pezzettini al genoma in costruzione, e queste sequenze sono rispettivamente la sequenza U3 al 5′ (prima della sequenza R) e di U5 al 3′, (dopo la sequenza R). In questo modo, quelle che nel genoma a RNA erano sequenze terminali diverse (R+U5 vs U3+R), ora sono diventate delle sequenze terminali identiche (U3-R-U5 e U3-R-U5) Queste sequenze sono chiamate LTR, Long terminal Repeats.

U3-R-U5_____________(DNA a doppio Filamento)______________U3-R-U5

All’interno del genoma, tra queste due LTR ci sono ovviamente i geni retrovirali. I tre geni più importanti sono chiamati Gag, env e pol, che codificano ciascuno per diverse proteine. Il gene gag codifica per le proteine del capside virale, Env codifica per le proteine dell’envelope e Pol codifca per proteine come la retrotrascrittasi, l’integrasi e la proteasi.
La trascrizione di questi geni inizia una volta che il Genoma a DNA si è integrato. I trascritti possono Monocistronici (ovvero contenere un solo gene) oppure policistronici. La maturazione delle proteine virali avviene poi attraverso la proteasi che dai precursori genera le proteine definitive.
Oltre a Gag, Pol e env, ci sono anche altri geni accessori che possono variare da retrovirus a retrovirus, e hanno il compito di facilitare l’operato del virus, molto famosa è, nell’HIV, la proteina Tat, codificata dal gene omonimo, che è un trans-attivatore, ovvero è una proteina che durante la trascrizione del genoma del virus integrato, si lega al trascritto nascente e permette di aumentare l’efficienza della trascrizione stessa consentendo la produzione di trascritti full-lenght, senza questa proteina il virus sarebbe in grado di sintetizzare solo messaggeri troppo corti.

Un vettore retrovirale sfrutta la capactà dei retrovirus di INFETTARE le cellule e di INTEGRARE il loro genoma in quello delle cellule ospiti. In questo modo possiamo trasferire e far esprimere geni che vogliamo ai nostri modelli sperimentali (linee cellulari, animali) in maniera permanente e stabile. Quello che ci serve prima di tutto è quindi il genoma di un retrovirus, all’interno di questo genoma che è solitamente lungo una decina di kilobasi, dobbiamo inserire il gene di interesse. I problemi sono 2, il primo è che la somma tra il genoma retrovirale e il gene di interesse non deve superare una soglia critica, perchè altrimenti il vettore non potrà essere inserito all’interno del virus (capside) stesso per motivi di spazio. Il secondo è che non possiamo lavorare con il genoma ad RNA. Per il primo problema si è fatto sì che si sviluppassero dei vettori retrovirali estremamente ridotti, ovvero contenenti soltanto le LTR terminali ed una sequenza molto importante chiamata di incapsidamento (spiegherò dopo il significato). In questo modo, avendo eliminato tutti i geni retrovirali, io posso inserire all’interno delle LTR il mio gene di interesse. Il secondo problema è stato aggirato lavorando su vettore retrovirale in DNA. Tra tutti i vettori retrovirali, i più diffusi sono quelli lentivirali (i lentivirus sono una sottoclasse dei retrovirus)

 

 

In questo Vettore retrovirale abbiamo le due sequenze LTR, e una sequenza Psi che è la sequenza di incapsidamento. Dopodichè abbiamo due geni, uno che codifica una proteina che conferisce resistenza all’ampicillina esterno alle LTR, e un altro che codifica una proteina che conferisce resistenza ad un altro antibiotico, la neomicina che è interno alle LTR e sotto un promotore specifico SV-40 (SV-40 è un promotore appartenente ad un virus delle scimmie, ma non un retrovirus). Che cosa servono questi due geni di resistenza antibiotica? Servono per selezionare. Per iniziare, devo trovare il sistema per inserire il gene di interesse nel vettore di cui vedete sopra un’immagine (esistono tantissimi tipi di vettori retrovirali, e lentivirali in particolar modo). Il modo tradizionale consiste nell’usare degli enzimi di restrizione. Un enzima di restrizione è un enzima che taglia un doppio filamento di DNA, riconoscendo una specifica sequenza. Se io taglio il mio vettore, con un enzima che riconosca una sequenza una sola volta, e che quindi faccia un solo taglio (Per fare questo c’è una mappa di restrizione che indica i diversi siti di taglio presenti sul vettore), e in particolar modo riconosca una sequenza presente nella regione chiamata MCS, io aprirò il mio vettore, lo renderò una molecola di DNA lineare. Il taglio deve generare preferibilmente delle sticky ends, in modo che, usando lo stesso enzima per il mio gene di interesse (facendo attenzione che non lo tagli in mezzo, ma solo alle estremità), Io potrò incastrare il mio gene di interesse all’interno del mio vettore linearizzato proprio perchè avranno le estremità complementari. Legando il mio gene al mio vettore, questo si ricircolarizzerà, generando una molecola di DNA circolare con dentro il mio gene. Il gene è inoltre stato inserito in mezzo alle due LTR retrovirali (perchè ho utilizzato un enzima che tagliasse nel MCS). Ci sono inoltre dei metodi per inserire il gene nella direzione giusta, in modo che sia sotto il controllo del giusto promotore retrovirale (clonaggio direzionale).
Dopodichè si utilizzano dei batteri, all’interno dei quali inseriamo il nostro vettore per aumentarne la quantità. Solo i batteri che hanno assunto il vettore saranno in grado di crescere in un terreno contenente ampicillina, in questo modo io seleziono esclusivamente i batteri che mi servono, quelli che hanno il vettore. La domanda che potreste fare è: ma se visto che ho due geni che danno la resistenza due antibiotici diversi, uno chiaramente per i batteri e l’altro per le cellule eucarioti, sono interscambiabili? Posso cioè utilizzare la neomicina per selezionare i batteri anzichè l’ampicillina? la risposta è no, perchè in questo caso il gene della resistenza alla neomicina è sotto un promotore specifico per le cellule eucarioti, e i batteri non lo leggerebbero, per cui i batteri non sono resistenti alla neomicina, mentre le cellule eucarioti non sono sensibili all’antibiotico ampicillina per cui la selezione invertita non funzionerebbe.
Una volta ottenute grandi quantità di vettore, devo passare allo step successivo. Ovvero creare il retrovirus che contenga come genoma il mio vettore che ho appena costruito. Per fare questo devo tenere conto di diverse cose. innanzitutto, il mio vettore retrovirale, che ho appena costruito da solo non è in grado di produrre nessun virus visto che gli mancano tutti i geni (che gli sono stati tolti per far spazio al gene di mio interesse). Pertanto devo utilizzare un sistema di vicariaggio, ovvero inserire artificilamente il mio vettore appena fatto in cellule apposta (trasfezione). Queste cellule sono chiamate cellule Helper, poichè portano al loro interno tutti i geni retrovirali necessari (gag, env, pol ecc) ma senza la sequenza di incapsidamento. Quindi le cellule helper sono in grado di fornire al mio vettore le proteine neccessarie a integrarsi e trascriversi, sono in grado fabbricare le proteine strutturali virali e quindi di fabbricare il corpo del virus all’interno del quale dovrà incapsidarsi il nostro vettore di interesse. A questo punto entra in gioco il secondo fattore, ovvero la sequenza di incapsidamento: mentre il vettore che contiene il gene di mio interesse contiene la sequenza di incapsidamento, quello che fornisce le proteine retrovirali no, pertanto è impossibile che si vengano a creare dei virus contenenti il vettore con gag env e pol, ma solo quello contenente il gene che voglio. Le cellule Helper sono ottenute infettando delle cellule con un retrovirus privato della sequenza psi; con i primi protocolli accadeva che durante il processo di produzione dei retrovirus, si generassero spontaneamente dei retrovirus replicazione competenti (al contrario di quelli che si volevano ottenere, dei virus replicazione-incompetenti); questa reversione spontanea era dovuta ad eventi di ricombinazione tra il vettore col gene di mio interesse e il vettore con i geni virali standard privato della sequenza psi. Per ovviare a questo problema, si iniziò a transfettare le cellule Helper con vettori separati: uno che codifica per i geni gag-pol, ed un secondo vettore che contiene invece il gene env. Il gene env è molto importante perchè codifica per le proteine di superficie, quelle dell’envelope, che sono le proteine con cui il virus riconosce le cellule e le infetta. Il gene env quindi detrmina la specificità (tropismo) del virus nei confronti dell’ospite. Oltre a questo accorgimento si iniziarono a togliere tutte le sequenze non indispensabili dai vettori helper, per ridurre la probabilità di ricombinazione.
Quindi alla fine della fiera, io inserisco il mio vettore retrovirale nelle cellule helper, e queste cellule helper dopo alcuni giorni di incubazione mi daranno numerose particelle virali contenenti il vettore di mio interesse, anche se sulla totatilità solo una percentuale sarà effettivamente attiva (alcune particelle potranno infatti essere vuote). Io quindi prelevo dal terreno di coltura di queste celluel helper i miei virus, e posso usarlo per infettare le mie cellule. Il virus che ho ottenuto, sarà quindi come stabilito, replicazione incompetente perchè il suo genoma non è in grado di produrre le proteine virali, questo fa sì che quando utilizzerò il virus appena prodotto per infettare le cellule designate, che non sono più cellule helper, ma cellule normali, si avrà soltanto il processo di infezione, di retrotrascrizione e di integrazione del genoma virale e non si avrà nessuna produzione di virus. Ovviamente le cellule da infettare devono essere compatibili con il virus ottenuto, e la compatibilità è data, come ho detto prima, dalle proteine dell’envelope.
Quindi, lo step finale è quello di utilizzare i virus prodotti per infettare le cellule, normalmente quello che si fa è di creare sia un controllo positivo che un controllo negativo. Il controllo positivo può essere un retrovirus contenete nel suo genoma il gene della GFP, in modo che questo renda facile la quantificazione dell’efficienza di infezione (in base al numero di cellule con la fluorescenza verde). Il controllo negativo è un vettore retrovirale vuoto, senza nessun gene inserito, questo serve a controllare gli effetti dell’integrazione casuale che il genoma retrovirale subisce. Inoltre, le cellule infettate col virus vengono fatte crescere in un terreno contenente neomicina (nel caso del vettore in figura), per selezionare solo le cellule che hanno integrato il vettore. Le cellule infettate quindi esprimeranno stabilmente il gene di mio interesse, e il vantaggio di usare vettori retrovirali è che l’efficienza di infezione è molto alta, molto più alta di qualsiasi altro metodo “gene-delivering”.

Ora, per finire, vorrei parlarvi delle apllicazioni pratiche di questo sistema. A cosa mi serve creare dei retrovirus per far esprimere geni di mio interesse? Beh, senz’altro a studiare gli effetti dell’espressione di uno o più geni in un sistema controllato. Ad esempio io trovo che in un particolare tipo di tumore ricorre una particolare mutazione in un gene specifico. Per dimostrare che questa mutazione sia o meno importante nella generazione del tumore, io posso utilizzare dei vettori retrovirali per infettare cellule che non esprimono quel gene con la forma mutata e con la forma standard e osservare le differenze di comportamento nelle cellule infettate.
Un altro campo di applicazione è la cosiddetta Gene-therapy, terapia genica, ovvero il tentativo di curare malattie attraverso l’espressione di geni estranei. Famoso è il caso del deficit di adenosina deaminasi (ADA-deficiency), una malattia genetica che causa una gravissima immunodeficienza congenita. Si è provato a prelevare le cellule staminali emopoietiche di bambini malati, e infettarle con un retrovirus contenente il gene dell’enzima ADA. Straordinariamente le cellule transgeniche, una volta reimmesse nel midollo osseo dei bambini, davano origine a cellule immunitarie funzionanti, eliminando così l’immunodeficienza. Questi sono rari casi di successo nei protocolli di terapia genica attualmente in corso. bisogna sottolineare come, essendo l’integrazione del virus casuale, questo possa rappresentare un rischio di mutagenesi-virus-indotta. Altre applicazioni consistono nell’utilizzare dei vettori retrovirali per far esprimere geni come l’insulina nei diabetici (in corso di sperimentazione), o di utilizzare questi vettori come “bombe” mirate a far suicidare le cellule tumorali (introducendo geni antiproliferativi come p53), il problema è quello di riuscire a costruire dei vettori specifici soltanto per le cellule tumorali.
Concludo con una nota sulla sicurezza in laboratorio durante la produzione di questi virus. Il pericolo maggiore per i ricercatori è quello ovviamente di infettarsi con il virus prodotto, questo ovviamente è tanto più possibile quanto più compatibile è il virus con l’essere umano. Per questo è obbligatorio seguire rigide preocedure di sicurezza (lavorare in laboratori attrezzati specificamente e adibiti apposta, lavorare sempre sotto cappa, indossare mascherina e indumenti protettivi ecc, buon senso)

Spero di non avervi annoiato! Se avete domande, usate i commenti!

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The enemy within

8 novembre 2011 in dendrite by Manuel | No comments

Il titolo non è mio, l’ho rubato da un editoriale pubblicato su Nature Medicine qualche tempo fa, mi piacerebbe illustrare bene l’argomento perchè è senz’altro interessante!
Attualmente, circa il 7-8% del nostro genoma è costituito da sequenze di chiara origine retrovirale. Credo sappiate tutti che cosa siano i retrovirus e che conosciate la loro importanza biologica, in ogni caso ho scritto qualche mese fa un articolo interamente dedicato a loro. La capacità di integrare sistematicamente il loro genoma (che da RNA viene retrotrascritto in DNA a doppio filamento) in quello della cellula ospite (grazie ad un ezima particolare chiamato Integrasi), con l’obiettivo di utilizzare i macchinari biosintetici della cellula per replicarsi, ha permesso che pezzi dei loro genomi rimanessero intrappolati negli ospiti e che venissero poi trasmessi di generazione in generazione. Non so se vi rendiate conto, ma l’8% di 3 miliardi di paia di basi (tant’è il nostro genoma) fa una discreta quantità di basi. Considerando poi che il DNA codificante nei mammiferi si aggira attorno al 1,5-2% c’è ben da rimanere meravigliati! Se è molto chiaro il meccanismo attraverso il quale si vengano a creare questi inserti, non è altrettanto chiaro il motivo per cui queste sequenze sono sopravvissute fino a noi, ma questo discorso si infila in una cornice più ampia che riguarda il significato biologico e funzionale di tutto il DNA non codificante, che rappresenta quindi il 98% del DNA umano, alla luce inoltre di numerosi studi che illustrano come nonostante questo DNA non contenga informazioni per sintetizzare proteine, venga comunque trascritto in RNA che costituiscono la cosiddetta materia oscura biologica (Dark Matter).
La struttura genomica di un retrovirus è abbastanza standard, nel virus il genoma è sottoforma di RNA a singolo filamento, ed è presente in doppia copia, quindi sono virus Diploidi. Una volta entrato nella cellula, grazie alla trascrittasi inversa ciascun filamento di RNA viene retrotrascritto in DNA a doppio filamento, ma il processo di retrotrascrizione, che ho descritto nel mio articolo apposito sui retrovirus, determina un’aggiunta di due sequenze terminali identiche chiamate LTR, Long Terminal Repeats. Queste sequenze terminali sono molto importanti, primo perchè determinano la successiva integrazione del genoma virale retrotrascritto (provirus) nel genoma della cellula ospite, grazie ad apposite sequenze riconosciute dall’integrasi, e secondo perchè contengono dei siti di legame per dei fattori di trascrizione cellulari, i fattori di trascrizione (di cui ho già parlato in altri articoli) sono delle proteine che, in genere sotto forma di dimeri, riconoscono sequenze apposite di DNA e favoriscono la trascrizione dei geni a valle di queste sequenze. Quindi le LTR fanno in modo che il genoma virale venga trascritto dagli stessi fattori di trascrizione e dalla stessa RNA polimerasi cellulare. Il problema è che queste LTR potrebbero in qualche modo favorire la trascrizione di geni cellulari oltre che virali, è un evento che per quanto raro non si può escludere. E’ come se si venisse a creare un modello sperimentale come quelli che solitamente i biologi costruiscono artificalmente, ovvero per fare esprimere un gene in un modello biologico (linea cellulare, animale) si associa questo gene ad un promotore cosiddetto forte, ovvero un promotore che è dimostrato funzioni bene in quel particolare modello, se voglio fare esprimere un gene in una linea cellulare epatica, di certo non andrò ad usare un promotore del gene della catena alfa dell’emoglobina perchè so già che è un gene silenziato negli epatociti e quindi non funzionerebbe, mentre protei usare un promotore di un gene che normalmente è espresso come quello della Piruvato chinasi (un enzima espresso in tutte le cellule dell’organismo in quanto indispensabile per la glicolisi). In questo caso abbiamo l’introduzione di un promotore virale, che per necessità dovrà essere un promotore forte, che potrebbe attivare la trascrizione di geni cellulari.
Normalmente tutte le sequenze retrovirali che sono fossilizzate nel nostro genoma non sono attive, anzi sono attivamente represse attraverso le metilazioni della citosina (un marcatore epigenetico che determina la totale inattività della sequenza). E’ possibile però che ci siano delle alterazioni nello stato della metilazione di alcune di queste sequenze e questo provocherebbe la riattivazione di queste LTR. Se queste LTR riattivate dovessero essere in prossimità di geni che favoriscono la proliferazione o sopravvivenza della cellula, i cosiddetti oncogeni, potremmo ritrovarci ad una possibile iniziazione tumorale, con una cellula potenzialmente senza controllo. Inoltre il concetto di prossimità a livello cromosomico è abbastanza relativo, ma proprio a proposito di questo volevo parlarvi di un articolo pubblicato sullo stesso numero dell’editroriale (per il quale l’editoriale è stato scritto), in cui dimostrano che in cellule di una determinata neoplasia, un Linfoma di Hodgkin, era attivata l’espressione in modo costitutivo di un gene, CSF1R (Colony Stimulating Factor 1 Receptor), la cui proteina è un recettore per un fattore di crescita CSF1 che normalmente è espresso a livello delle cellule staminali emopoietiche e che poi viene represso quando le cellule si differenziano nelle cellule del sangue. Infatti mentre le linee cellulari derivate dai campioni tumorali esprimevano sia il recettore che il ligando (In questo modo le cellule tumorali si autostimolano in un modo conosciuto come Loop Autocrino), le linee cellulari non tumorali no. Dimostrato il ruolo oncogenico di CSF1-CSF1R, i ricercatori hanno dimostrato (sequenziando il trascritto di CSF1R) che nel messaggero del gene era inclusa una porzione di 250bp che normalmente dovrebbe stare molto più a monte del gene stesso (6 Kilobasi), questa sequenza allineava con una sequenza retrovirale, che aveva perduto le metilazioni che la inattivavano e quindi aveva iniziato a stimolare l’espressione del gene in questione, e che evidentemente si fondeva con il trascritto per un evento di splicing alternativo.

Ovviamente ho fatto un riassunto molto stringato dell’articolo, consiglio a chi potesse di andarselo a leggere, darò le indicazioni nella bibliografia. In ogni caso credo sia chiaro che cosa significhi l’espressione the enemy within, e credo anche che bisognerebbe riflettere ulteriormente sul significato biologico di queste sequenze retrovirali fossilizzate nel nostro genoma.
Come ulteriore consiglio, suggerisco di leggere anche il mio vecchio articolo sui Virus (e retrovirus) oncogeni, che chiude il quadro della questione.

Se avete domande o qualsiasi altra cosa da dire usate i commenti! Alla prossima.

Mi sono basato su:

Lamprecht et al, “Derepression of an endogenous long terminal repeat activates the CSF1R proto-oncogene in human lymphoma”, Nature Medicine, May 2010;

Michael E Engel & Scott W Hiebert: The enemy within: dormant retroviruses awaken. Nature Medicine, May 2010;

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La fortunata progenie dell’Acido Arachidonico

7 novembre 2011 in dendrite by Manuel | No comments

Il discorso si preannuncia complicato, cercherò di renderlo al meglio! Mi piacerebbe spiegare come, a partire da una determinata molecola si possa generare un sistema di comunicazione intercellulare estremamente raffinato ed importante, sto parlando del sistema di comunicazione paracrino basato sull’Acido Arachidonico.

L’acido arachidonico (AA per gli amici) appartiene alla famglia degli acidi grassi, che non sono degli acidi che hanno bisogno di essere messi a dieta, ma delle molecole costituite da una catena idrocarburica, il cui numero di atomi è variabile (da quattro atomi a trentasei), e alla cui estremità è presente un gruppo acido (COOH). Essendo idrocarburi gli atomi di carbonio sono legati ad atomi di idrogeno, e questo rende la molecola dell’acido grasso quasi totalmente apolare e pertanto idrofobica.  La struttura generale di un acido grasso è questa:

CH3(CH2)nCOOH

Questa è la struttura di base di un acido grasso saturo, ovvero privo di doppi legami. I doppi legami, chiamati anche insaturazioni, conferiscono numerose proprietà chimico-fisiche, basti pensare alla differenza tra una miscela di grassi prevalentemente saturi ed una miscela di grassi prevalentemente insaturi, rispettivamente burro e olio; l’AA è un acido grasso poliinsaturo a 20 atomi di carbonio, quindi che contiene più di un doppio legame e precisamente tra il C5 e il C6, tra il C8 e il C9, tra il C11 e il C12 e tra il C14 e il C15. L’acido arachidonico è presente nelle membrane biologiche, nelle membrane quindi delle nostre cellule, così come molti altri acidi grassi, a formare i fosfolipidi.

L’acido Arachidonico è il precursore di numeroissime molecole che funzionano da importantissimi messaggeri localmente tra una cellula e l’altra.
Come funziona l’AA? Come ho detto, è un acido grasso che è localizzato nelle membrane cellulari. In risposta a particolari stimoli (dopo faremo degli esempi), si attiva un enzima cellulare praticamente ubiquitario chiamato PLA (Fosfolipasi A), questo enzima è attivato da numerosi segnali intracellulari, tra i quali anche l’aumento della concentrazione di Calcio intracellulare (Ca++); il calcio è un secondo messaggero universale e le variazioni delle sue concentrazioni determinano risposte cellulari ben precise. Questo enzima libera l’AA dalle membrane e lo rende disponibile ad altri enzimi cellulari. I due enzimi più importanti sono le Cicloossigenasi e le Lipoossigenasi.
Esistono due isoforme delle Cicloossigenasi (COX), la COX-1 e COX-2, la prima è ubiquitaria, mentre la seconda è inducibile (Pare ci sia anche una terza isoforma, la COX-3, ma alcuni ritengono sia solo una variante della prima). L’azione delle COX è duplice, la prima reazione che catalizzano è quella di ossidare l’AA con due molecole di ossigeno e ottenere un anello a 5 atomi di C; la seconda reazione è una perossidazione del C15 dell’intermedio, e la molecola così ottenuta è la prostaglandina H2, (Per meglio capire cliccare Qui) dalla quale, grazie a numerose enzimi chiamati PG-sintasi otteniamo i Prostanoidi, una serie di molecole dalle azioni più disparate. I derivati dell’AA sono comunque sempre molecole apolari e pertanto potranno diffondere liberamente tra una cellula e l’altra.
Tra i prostanoidi annoveriamo le Prostaglandine (PG), che sono molto importanti nell’infiammazione, la fisiologica risposta dell’organismo a un danno, fisico, chimico o biologico che sia. Durante un evento infiammatorio, infatti, la sintesi di PGs è enormemente aumentata, salvo poi tornare a livelli nulli quando la risposta infiammatoria si spegne. In molti casi favoriscono il reclutamento delle cellule del sistema immunitario nel tessuto infiammato (chemiotassi), aumentano la sensibilità al dolore, regolano la temperatura corporea provocando la febbre. La diversità delle prostaglandine è dovuta alla presenza di numerose prostaglandina-sintasi, che operano in seguito all’attività delle COX. Un esempio di azione delle prostaglandine può essere dato nei casi di asma allergica, dove l’infiammazione del tessuto bronchiale, in seguito all’esposizione a particolari antigeni, provoca la produzione anomala di prostaglandine che determinano la classica broncocostrizione.
E’ noto inoltre che nei tumori solidi (carcinomi e sarcomi) si viene a creare un microambiente tumorale infiammatorio, perchè possiamo ben supporre che la crescita incontrollata delle cellule tumorali, lenta o rapida che sia, rappresenti un danno al tessuto sano. Il sistema immunitario viene così attivato contro questo “danno tissutale” generando così una infiammazione che perdura, che non si viene ad esaurire perchè la stessa causa dell’infiammazione perdura (infiammazione cronica). E’ noto pertanto che in diverse occasioni questo microambiente tumorale infiammatorio possa favorire la crescita stessa del tumore.
Altri prostanoidi sono i trombossani che vengono prodotti a partire dalla PGH2 grazie alle Trombossano sintasi nelle piatrine in risposta ad un danno ai vasi sanguigni. I trombossani favoriscono l’aggregazione piastrinica e attivano la vasocostrizione nel luogo del danno vascolare. E’ quindi chiaro che i trombossani, dervati dall’AA grazie alle COX, hanno un’azione pro-coagulante.

Come forse molti di voi sapranno, gli enzimi COX (1 e 2) sono un bersaglio farmacologico molto importante già da tantissimo tempo. I cosiddetti Farmaci antiinfiammatori non steroidei (FANS in italiano e NSAID in inglese) sono degli inibitori selettivi di una o di entrambe le isoforme. Inibire le COX significa inibire la produzione di prostanoidi determinando quindi uno spegnimento dell’infiammazione qualora questa provochi degli effetti spiacevoli (dolore, febbre, ecc..). Questi farmaci sono tra i più utilizzati comunemente, Ad esempio parlo (principi attivi) dell’Acido acetilsalicilico, dell’Ibuprofene, del Ketoprofene del Nimesulide (commercialmente noti come Aspirina, Moment, Oki, Aulin), utilizzati principlamente come 1) antidolorifici e 2) antinfluenzali. Di questi solo l’aspirina è un inibitore irreversibile. L’irreversibilità dell’azione dell’aspirina è  responsabile degli effetti paralleli del farmaco, che infatti è un fluidificatore del sangue proprio perchè inibisce irreversibilmente la produzione di Trombossani, e visto che le piastrine non sono in grado di sintetizzare enzimi (non hanno nucleo) è necessario aspettare che altre piastrine vengano immesse in circolo (a partire dal loro precursore cellulare, il megacariocita) perchè si riacquisti la capacità di coagulare correttamente. Un altro problema che un uso eccessivo di aspirina, ma in generale di NSAID, può provocare è l’ulcerazione gastrica o intestinale. Alcune prostaglandine infatti hanno un attività gastrica e intestinale di aumentare la produzione di muco protettivo contro gli acidi gastrici, che quindi diminuiscono in seguito al blocco reversibile o irreversibile delle COX.
Diminuendo l’infiammazione, alcuni studi hanno dimostrato che questi farmaci hanno un azione protettiva nei confronti di alcuni tipi di tumore (per i motivi che ho detto prima), da qui però a dire che basta prendere un’aspirina per risolvere il problema ce ne va!
Da diversi anni è in commercio una nuova generazione di COX-inhibitor, che sono altamente specifici per l’isoforma 2, uno di questi il Rofecoxib (Vioxx) prodotto dalla Merck è stato ritirato dal mercato statuintense perchè aumentava (raddoppiava secondo le stime) il rischio di avere infarti o ictus provocando (giustamente) una marea di polemiche sui controlli della FDA (aveva fatto un servzio anche Report anni fa).

Ma all’inizio avevo detto che erano due le vie enzimatiche che l’AA poteva intraprendere, mutualmente esclusive, una era appunto quella delle COX, l’altra era quella della Lipoossigenasi. La 5-Lipossigenasi è un enzima presente nelle cellule del sistema immunitario (le COX sono ubiquitarie). L’azione di questo enzima (perossidare un acido grasso) è quella di creare una serie di derivati che prendono il nome di leucotrieni, anch’essi responsabili di molti processi infiammatori, particolarmente nota è la loro funzione nell’asma, dove assieme ad alcune prostaglandine determina la broncocostrizione, per se siete asmatici durante un attacco non vi conviene prendere un’asprina convinti che in questo modo vi passi tutto perchè le PG smettono di essere prodotte, perchè diminuire l’attività delle COX aumenta l’attività della lipossigenasi con aumento di leucotrieni con un possibile peggioramento.

Spero che questo articolo sia stato interessante. La mia intenzione era quella di mostrare come nel nostro organismo ci siano dei raffinatissimi sistemi di comunicazione cellulare che permettono la coordinazione di numerosi processi, come quelli infiammatori.

 

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Gli amanti degli estremi

12 ottobre 2011 in dendrite by Manuel | No comments

Questo articolo è stato scritto per la V edizione del Carnevale della Biodiversità, ospitato dal blog Theropoda di Andrea Cau!. Il titolo di questa edizione è AI CONFINI DELLA REALTÀ: NICCHIE ESTREME.
Chi di voi, alla domanda “Chi sono i veri dominatori di questo pianeta?”, risponderebbe: “l’uomo”? Spero nessuno. I più accorti risponderebbero “Gli insetti”, ma solo quelli veramente informati risponderebbero con l’unica opzione veramente sensata: “I microrganismi”. I microrganismi sono forme di vita unicellulari, ma poichè esistono sia unicellulari eucarioti sia procarioti, a scanso di equivoci, io mi riferirò solo ai procarioti. I primi fossili di cellule procarioti (le stromatoliti) sono piccole cellule bastoncellari risalenti a 3.5 miliardi di anni fa.
Ovviamente nessuno dei procarioti attuali può essere considerato paragonabile ai loro progenitori fossili, ma il fatto è che sopravvivono da tre miliardi e mezzo di anni sempre mantenendo la stessa struttura unicellulare; se questo non significa avere avuto successo, non saprei cos’altro potrebbe volerlo dire.
I procarioti sono cellule molto più semplici e piccole rispetto alla più piccola cellula eucariote. I procarioti sono comunemente noti come batteri, ma bisogna fare una distinzione importante, i procarioti si dividono in due domini filogeneticamente distinti: Bacteria e Archea. Da un punto di vista evolutivo si ritiene che le cellule eucarioti abbiano un antenato comune più vicino con gli Archea che non con i Bacteria. Per semplicità sia archea che bacteria verranno generalmente definiti come batteri o procarioti, ma specificherò quando parlerò degli uni e quando degli altri.
Attualmente i procarioti hanno colonizzato praticamente ogni ambiente (dalle profondità abissali, alle acque termali, alle solfatare, al vostro intestino) e questo è dovuto principalmente a due caratteristiche:

1)      Grande capacità di adattarsi a condizioni ambientali estreme, condizioni a cui nessun altro organismo potrebbe sopravvivere (o per lo meno quasi).

2)      Capacità di produrre energia da innumerevoli fonti non utilizzate da altri organismi.

Un’altra caratteristica dei microrganismi è quella di adattarsi rapidamente a nuove condizioni ambientali, basti pensare alla moltiplicazione di ceppi batterici resistenti agli antibiotici in neanche un secolo.
Tutti i microrganismi in grado di crescere in ambienti estremi vengono chiamati con grande fantasia estremofili. In questo articolo è mia intenzione occuparmi di alcuni di essi.
Sicuramente tra gli ambienti più ostili alla vita ci sono quelli cosiddetti ipersalini, quelli in cui ci sono concentrazioni di sali (o degli ioni da essi derivati, in particolar modo Cloruro di Sodio) molto alti. Rientrano tra questi ambienti le saline, il grande lago salato e il mar morto. Per essere ipersalino un ambiente deve avere concentrazioni saline tra 3M (3 moli/litro) fino a 5.5M (limite di saturazione del sale).

itchfield Carol, “Survival Strategies for microorganisms in hypersaline environments and their relevance to life in early mars” Meteoritics and Planetary Science 1998

Con un’elevata concentrazione di sali nell’ambiente extracellulare l’acqua tende a fuoriuscire dalle cellule, facendole disidratare.
I microrganismi che riescono a crescere in condizioni di elevata salinità si chiamano alofili. Distinguiamo i microrganismi alotolleranti, che possono crescere sia in assenza di sale che in concentrazioni fino a 4M, e in alofili estremi che non crescono in ambienti con concentrazioni minori di 1.5-2.0M. Devo sottolineare come anche alcuni eucarioti unicellulari (in particolare l’alga verde Dunaliella salina) sono in grado di crescere in queste condizioni.
Come potete vedere dalla tabella, oltre alla salinità c’è da tener conto anche del pH, che in molti casi è estremamente alcalino.

In questi ambienti possono vivere e proliferare molte specie di batteri e di archea. Tra i batteri menzioniamo i Batteri Purpurei fototrofi (generi Halorhodospira, Ectothiorhodospira). La loro caratteristica principale è quella di effettuare una fotosintesi anossigenica, ovvero produrre energia utilizzando le radiazioni solari, senza produrre ossigeno (perché nella fotosintesi ossigenica viene utilizzata l’acqua come donatore di elettroni producendo ossigeno, mentre nei batteri purpurei viene utilizzato solfuro di idrogeno, tiosolfato, o altre molecole inorganiche). Possiedono  numerosi pigmenti fotosintetici come le batterioclorofille e carotenoidi che spesso danno colorazioni caratteristiche agli ambienti in cui fioriscono.

Saline della Camargue, il colore rosa è dato dai pigmenti dei batteri iperalofili

(Biotecnologie per tutti)

Questi microrganismi fototorofi rendono possibile lo sviluppo di altri alofili eterotrofi, in particolare gli Archea appartenenti ai generi Halobacterium, Natronobacterium e Natromonas. La domanda è come fanno questi microrganismi a non disidratarsi? Gli alofili estremi hanno la particolarità di accumulare soluti (in particolare K) al loro interno, infatti, grazie a particolari sistemi di trasporto ionico presenti sulle loro membrane, espellono il sodio (che tende ad entrare, seguendo il suo gradiente elettrochimico) e accumulano potassio (che tende ad uscire); questi accumuli di soluti pareggiano o addirittura superano la concentrazione di sali nell’ambiente esterno, pareggiando il bilancio idrico o addirittura rendendolo positivo.

L’altro caso di cui volevo parlare è quello dei termofili, in particolare gli ipertermofili la cui temperatura ottimale di crescita è superiore agli 80°C. I primi ipertermofili ad essere scoperti furono quelli presenti nelle sorgenti calde (hot springs) nel parco di Yellowstone.

Emerald Pool, una sorgente calda nel parco nazionale di Yellowstone, anche qui i colori sono dati da batteri ipertermofiliYellowstone National Park

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Le acque di molte sorgenti termali possono raggiungere temperature vicine ai 100°C, la domanda è come fanno i sistemi cellulari a resistere a tali temperature. A livello cellulare, il calore è in grado di far denaturare le proteine, che in questo modo perdono la loro funzionalità. Le proteine dei microrganismi ipertermofili, rispetto alle stesse dei microrganismi che vivono a temperature normali, hanno alcuni amminoacidi diversi e sono in grado di resistere e funzionare ottimamente a queste temperature senza denaturarsi (anzi, smettono di funzionare a temperature più basse). Anche le membrane sono specializzate e resistono alle alte temperature, e al posto degli acidi grassi (fosfolipidi) hanno una membrana costituita da idrocarburi estremamente lunghi che formano non un bilayer, come ci si aspetterebbe per una membrana, bensì un monolayer, rendendola così più termostabile. Tra i Bacteria, possiamo menzionare il genere Acquifex (e contiene i microrganismi più termofili di tutti i Bacteria); Le specie di questo genere utilizzano molecole inorganiche come fonte di energia, il particolare ossidano Idrogeno (H2), Zolfo (S) e possono essere aerobi, ma solitamente tollerano concentrazioni molto basse di ossigeno. La loro temperatura ottimale è di 85°C. I maggiori ipertermofili sono pero degli Archea, alcuni generi del phylum dei Crenarchaeota (trovati in solfatare, fumarole nere, acque termali) e degli Euryarchaeota. Anche in questo caso, questi microrganismi possono servirsi di zolfo e solfuri come fonte di elettroni per il loro metabolismo (in particolare quelli che vivono nelle solfatare) mentre altri si servono dello zolfo come accettore finale degli elettroni: mentre tutti gli organismi aerobi, noi compresi, utilizziamo l’ossigeno come accettore finale degli elettroni sottratti alle molecole organiche durante il metabolismo, molti microrganismi si servono dello zolfo riducendolo a acido solfidrico; ma non è un caso, zolfo e ossigeno sono nello stesso gruppo sulla tavola periodica (colonna) perché hanno propietà molto simili!

Un altro genere interessante è Methanopyrus, che è caratterizzato dall’avere specie metano gene in grado cioè di produrre metano: 4H2 + CO2 -> CH4 + H2O, in questo caso l’accettore di elettroni è l’anidride carbonica, mentre il donatore è l’idrogeno, entrambi molto abbondanti negli habitat in cui si trovano questi microrganismi: fumarole nere alle profondità di 2000 metri e a temperature di 110°C (Methanopyrus kandleri).

Abbiamo visto, quindi come svariati generi e numerosissime specie di microrganismi abbiano colonizzato ambienti estremamente proibitivi, da sottolineare comunque come i microrganismi non possono essere considerati come forma di vita primitive, perché nulla hanno a che vedere con quelli presenti miliardi di anni fa, ma questi stessi microrganismi dimostrano come non è necessario avere un grande cervello o il pollice opponibile per colonizzare il globo.

BIBLIOGRAFIA:

Madigan Michael T., Martinko John M. “Brock. Biologia dei microrganismi”

Litchfield Carol, “Survival Strategies for microorganisms in hypersaline environments and their relevance to life in early mars” Meteoritics and Planetary Science 1998

Kurr, M., Huber, R., Konig, H., Jannasch, H.W., Fricke, H., Trincone, A., Kristjansson, J.K., and Stetter, K.O. “Methanopyrus kandleri, gen. and sp. nov. represents a novel group of hyperthermophilic methanogens, growing at 110°C.” Arch. Microbiol. (1991)

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