Cellule in Vitro

Se dovessi pensare alla cosa che ha rivoluzionato maggiormente la vita dei biologi, nei laboratori e non, mi verrebbe da pensare subito a due cose: la scoperta del DNA e la PCR con le sue mille varianti. C’è però un’altra cosa che secondo me merita di entrare in questa cerchia elitaria: la coltivazione delle cellule in vitro. Forse non tutti lo sanno, ma già da molti anni quasi tutti i laboratori di biologia cellulare/molecolare, ma non solo, ricorrono senza sosta a “colonie” di cellule fatte crescere in vitro, ovvero su delle apposite piastre o in delle apposite fiasche.  Adesso a disposizione esistono un’infinità di linee cellulari, umane o di altri animali (topo, scimmia, criceto ecc). Cosa sono le linee cellulari? Una linea cellulare è un insieme di cellule provenienti tutte da una stessa fonte. Ad esempio la linea cellulare HEK (Human Embrionic Kidney) deriva da rene embrionale umano, La linea NIH è costituita da fibroblasti di Topo, La linea HeLa deriva da un tumore (del collo dell’utero, mi pare) trovato in una certa Henrietta Lacks (da qui il nome HeLa) a metà dello scorso secolo, e che da allora si trovano in tantissimi laboratori. Potrei continuare per molto tempo ancora. Vi mostro ora come si presenta al microscopio una coltura cellulare

(Cellule Hela)

Le linee cellulari possono derivare direttamente da un organismo (da un polmone, da un rene, dal cuore) e si parla di linee cellulari primarie. Oppure possono derivare da generazioni successive alla prima. Derivando da un organo, le cellule non sono ovviamente pronte all’uso. Innanzitutto sono all’interno di una matrice extracellulare, dalla quale bisogna estrarle, ad esempio attraverso l’uso di collagenasi (enzimi che digeriscono il collagene, che secondo ditte di cosmetica servirebbe a far ringiovanire la pelle); se invece le cellule sono fianco a fianco (es. Cellule epiteliali) si utilizzano enzimi come la tripsina. In ogni caso, dopo una serie di generazioni, queste cellule vanno incontro a senescenza cellulare e smettono di replicarsi. Questo perchè le cellule in vitro (ovvero in provetta) così come quelle in vivo (nell’organismo) hanno un potenziale replicativo limitato, dovuto all’accorciamento dei telomeri, ovvero di sequenze altamente ripetitive di DNA poste alle estremità dei cromosomi che si accorciano ogni divisione cellulare. Superata una certa soglia, le cellule entrano in una fase del loro ciclo vitale in cui non si replicano più. I telomeri sono una specie di orologio cellulare, e il motivo per cui si accorciano è dovuto al peculiare meccanismo di replicazione del DNA, che non starò a spiegare qui, ma se qualcuno ne volesse sapere di più può chiedere!
Oltre ad avere un potenziale replicativo limitato, queste cellule hanno la particolarità di crescere in un monostrato, appiccicate alla piastra di coltura. Una volta coperta tutta la superficie con un monostrato di cellule, smettono di replicarsi. Questo meccanismo viene chiamato inibizione da contatto, ed è dovuto a delle interazioni cellula-cellula che dicono a queste ultime di smettere di replicarsi perchè non c’è più spazio. E’ un efficiente meccanismo di controllo della proliferazione, e avviene anche fisiologicamente nei nostri tessuti. Ad esempio, nel fegato di un organismo adulto, gli epatociti non replicano nemmeno a pagarli; sono cellule stabili. Ma se attraverso un’operazione chirurgica si asporta una porzione di fegato, le cellule epatiche iniziano a replicare ed in pochissimo tempo l’organo ritorna alle dimensioni originarie. In esperimenti su topi, la resezione chirurgica di 3/4 del fegato veniva rimpiazzata nel giro di una sola settimana! (la capacità straordinaria del fegato di rigenerarsi era nota sin dall’antichità, se pensate al mito di Prometeo). Fattostà che nel giro di poco le cellule smettono di dividersi. Come fare? O si ricomincia tutto da capo, partendo dall’organo, oppure si procede ad immortalizzazione. Le cellule immortalizzate hanno la capacità di replicarsi indefinitamente perchè esprimono un enzima normalmente silenziato nelle cellule normali (ma non in quelle staminali) che viene detto telomerasi. Questo enzima è in grado di riallungare i telomeri.
Sono invece disponibili cellule cosiddette trasformate, che non solo hanno un potenziale replicativo altissimo, ma hanno perso ogni controllo della proliferazione cellulare, per cui sono in grado di crescere in pluristrato, formando spesso dei mucchietti pluristratificati, chiamati Foci (singolare focus). I foci sono una scoperta dei virologi di diversi decenni fa, i quali usavano delle colture cellulari per far sviluppare i loro virus; vedevano che mentre nella maggiorparte dei casi le cellule venivano lisate, con produzione di Virus, in altri si formavano questi mucchietti. Erano cellule trasformate dai virus stessi.  Sono cellule di origine tumorale, come le HeLa, oppure sono cellule sperimentantalmente trasformate inserendo geni oncògeni o utilizzando alcuni tipi di virus (Alcuni tipi di virus, chiamati Virus trasformanti acuti, sono i più potenti agenti cancerogeni che esistano: sono in grado di trasformare cellule in tempi brevissimi e con altissima efficienza, mentre solitamente ci vogliono anni).
In ogni caso le cellule vanno nutrite. Un tempo, agli albori di queste tecniche, si dava sangue intero, o plasma/siero. Adesso, ci sono appositi terreni di crescita, liquidi per lo più, con un adeguato contenuto di amminoacidi, sali, vitamine, zuccheri ed altri elementi, il più famoso dei quali è il DMEM: Dulbecco Modified Eagle’s Medium.

(dmem)

Si continua ad aggiungere siero, in genere al 5-10% in particolare FBS (Fetal Bovine Serum) contenente una serie di fattori di crescita utili. Inoltre le cellule sono solitamente messe in piastre come queste:

e periodicamente il terreno deve essere cambiato. Quando le cellule superano la capienza massima della piastra è necessario trasferirle in altre piastre per dar loro più spazio.

Un punto delicato delle colture cellulari è ovviamente la sterilità. Le colture non devono essere contaminate da batteri, funghi od altre cose, per ovvi motivi. Questo rappresentava un serissimo problema, quaranta/ciquanta anni fa, quando non esistevano mezzi per garantire la sterilità. Oltre all’aggiunta di antibiotici,  oggi si lavora sempre e solo sotto cappa. Cos’è la cappa? Ovviamente non quella delle cucina, ma il principio è lo stesso. E’ uno strumento, solitamente chiuso da tutti i lati, tranne su uno, che è il lato da cui lavora l’operatore. Può avere anche notevoli dimensioni e non fa altro che aspirare e filtrare l’aria e al cui interno si può lavorare, come quella della figura:

Esistono diversi tipi di cappe. Quelle di classe I che aspirano l’aria dall’esterno, e la filtrano prima di rilasciarla. Queste non vanno bene per lavorare in sterilità, perchè proteggono l’operatore  filtrando l’aria in uscita, ma non il materiale biologico che sta dentro la cappa. Le cappe di classe II, dette anche a flusso laminare, invece sono adatte per lavorare in sterilità, in quanto l’aria è filtrata sia in entrata che in uscita. Si lavorano le cellule in cappe di questo tipo, avendo cura di usare sempre e solo materiale sterile. Infine ci sono le cappe di classe III, nelle quali l’operatore non entra direttamente in contatto con il materiale biologico, ma lavora attraverso dei guanti incorporati nella macchina stessa. Sono adatte per lavorare con agenti infettivi estremamente pericolosi quali ad esempio Ebola. In Italia solo due ospedali, che io sappia, sono dotati di cappe di classe III, uno a Roma (lo Spallanzani, se non erro) e un altro a Milano, ma mi sfugge qual è.
Nonostante oggi si lavori sotto cappa con tutti gli accorgimenti possibili ed immaginabili, le contaminazioni sono sempre possibili, in particolare da microorganismi appartenenti al genere di Mycoplasma, che sono dei batteri intracellualari, estremamente difficili da eradicare e molto infettivi, per cui ogni tot di tempo è necessario controllare se le colture cellulari risultano positive al mycoplasma, ad esempio attraverso delle PCR.
Passiamo ora a parlare dell’utilizzo di queste colture cellulari. Praticamente sono ubiquitarie e possono essere utilizzate per moltissimi scopi, e questo le rende estremamente utili.Le colture cellulari sono utilizzate ad esempio per testare in vitro l’efficacia dei farmaci. Oppure possono essere utilizzate per fare crescere Virus contro i quali poi sviluppare eventuali vaccini. Possono essere usate, in oncologia molecolare, per vedere se una particolare mutazione è in grado di causare una trasformazione cellulare, inserendo il gene mutato nelle cellule, attraverso la trasfezione, e vedendo se queste cellule sono in grado di diventare cellule tumorali. Si usano per studiare l’espressione genica, e le variazioni dell’espressione genica in diversi contesti.  Ma gli utilizzi sono davvero infiniti.

Spero di non essere stato noioso, e se avete domande od obiezioni usate come sempre i commenti. Alla prossima!