L’elettroforesi è una tecnica basilare non solo della biologia, ma anche della diagnostica in generale. Trova un sacco di applicazioni dovute alla sua versatilità. Le elettroforesi più comunemente utilizzate solo le elettroforesi su Gel e si basano sulla capacità delle molecole biologiche di migrare in un campo elettrico. Questa capacità è dovuta dal fatto che la macromolecola biologica possiede una carica elettrica totale, positiva o negativa, e quindi, se posta in un campo elettrico, migrerà verso l’elettrodo di carica opposta.  Questa capacità di far migrare una carica in un campo elettrico può essere sfruttata per separare  le nostre molecole in base al loro rapporto z/m dove z solitamente simboleggia la carica e m, ovviamente, la massa, (anche se, parlando di molecole, dovrebbe essere Mw: molecoular weight e misurarsi non in grammi ma in dalton, ma alla fine è il concetto ad interessarci).
Le molecole che di solito vengono separate in elettroforesi sono solitamente gli acidi nucleici (DNA, RNA) e le proteine. essendo due classi di molecole diverse, meritano attenzioni distinte. Ora passiamo ad illustrare la tecnica in generale.

Come facciamo a preparare un’elettroforesi? Abbiamo bisogno di un gel, un supporto, generalmente di plastica, in cui inserire il gel e in cui attaccare gli elettrodi, un generatore di voltaggio, e una soluzione tampone, che serve a formare il contatto elettrico tra gli elettrodi e il gel (in pratica favorisce il flusso delle cariche). Esistono due tipi di gel: i gel di agarosio e i gel di poliacrilammide; L’agarosio è un derivato polisaccaridico di alcuni tipi di alghe, mentre l’acrilammide, che è il monomero che costituisce, appunto, le molecole di poliacrilammide, è una neurotossina e pertanto, durante la preparazione, questo gel va trattato con attenzione. Sin da ora vi dico che, qualora trovaste la sigla AGE, questa sta per: Agarose Gel Electrophoresis, mentre la sigla PAGE sta per:PolyacrylAmide gel Electrophoresis.
L’ultrastruttura di questi gel è costituita da pori, i quali permettono la migrazione delle molecole. Le dimesioni dei pori sono controllabili dall’operatore in base alla percentuale di Agarosio e di Acrilammide. Più i pori sono larghi, più facilmente le molecole migreranno, più sono stretti, e più, ovviamente, incontraranno resistenza.
Quando si prepara il gel, solitamente lo si allestisce diluendo l’agar o l’acrilammide in un tampone a temperature elevate (di solito si utilizza un microonde) e pertanto, inizialmente, il gel sarà liquido. Soltanto quando si raffredderà assumerà la tipica consistenza gelatinosa. Durante il raffreddamento, si inserisce alla sommità del gel un pettine (non quello per i capelli, ma la struttura è simile), i cui dentelli formeranno, nel futuro gel, dei pozzetti dentro ai quali si inseriranno i campioni da far correre.

il gel così formato verrà inserito nel supporto di plastica, i campioni verranno caricati nei rispettivi pozzetti (questa è una operazione che è divertente quanto stressante da eseguire, perchè è piuttosto difficile vedere i pozzetti trasparenti su un gel trasparente anch’esso; è perciò piuttosto facile rompere i pozzetti, oppure non centrarli e quindi riversare il campione al di fuori. Ci vuole solo un po’ di manualità, e ricorrere a qualche trucco, come mettere uno striscio di carta colorata sotto al gel in modo da far risaltare i pozzetti). Si ricopre il gel di soluzione tampone, si attaccano gli elettrodi (facendo attenzione e non invertirli), si aziona il generatore di voltaggio (generalmente 80V per 30 minuti) e si attende. quindi si preleva il gel e si mettono in evidenza le bande così ottenute. Generalmente, uno dei classici metodi per mettere in evidenza il DNA si basa sull’utilizzo di agenti intercalanti come l’etidio bromuro o il propidio ioduro che se eccitati con UV sono fluorescenti. Siccome però questi sono agenti cancerogeni molto pericolosi, ora si utilizzano altri agenti (SYBR GREEN).. anche se noi in laboratorio abbiamo usato il bromuro di etidio, ma lasciamo perdere. Per quanto riguarda le proteine, invece, si utilizzano altri coloranti, come il blue comassie. Più o meno, ecco come si presenta il tutto:

legenda:

Well: pozzetto
Buffer: Tampone
SDS-PAGE: Elettroforesi in Gel di PoliacrilAmmide con Sodio Dodecil Solfato (vedremo dopo cos’è questo componente)

Quest’immagine mostra chiaramente come le molecole grandi corrano di meno nel gel rispetto a quelle piccole. in questo caso sono mostrate proteine.

Ora due considerazioni di carattere tecnico. La prima riguarda il fatto che, come potete vedere nella figura, i pozzetti con i campioni da far correre sono in alto, o comunque ad un marigine del gel. Questo significa che dovremo fare attenzione a come posizioneremo gli elettrodi per far sì che i campioni corrano verso basso e non verso alto. se ho del DNA, questo avrà carica negativa; tenderà a spostarsi verso l’elettrodo positivo (l’anodo), che andrà pozionato quindi dalla parte opposta dei pozzetti. se noi lo posizonassimo sullo stesso lato, non otterremo nessuna corsa perchè lo spazio è troppo breve.
La seconda riguarda invece la preparazione dei campioni per la corsa. Ho detto all’inizio che la corsa elettroforetica sarà influenzata dal rapporto z/m. Ma dobbiamo tener conto anche di un altro fattore, ovvero la forma del campione, dove per forma intendo la struttura. Come sappiamo, sia gli acidi nucleici che le proteine hanno delle conformzioni piuttosto complesse, queste influenzano significativamente la corsa di un campione. Pertanto spesso si aggiungono dei denaturanti in modo da standardizzare la situazione. In più va detto che poichè le proteine possono avere carica variabile (gli amminoacidi hanno cariche diverse) si utilizza durante la corsa un agente che oltre a denaturarle, conferisce loro una omogenea carica negativa, in modo che la corsa avvenga solo in base alla MW, questo agente è l’SDS (sodio dodecil solfato).

Alla fine, dopo tutta questa tiritera, avrete un risultato simile:

In questo gel sono presenti due set di campioni  separai (DNA), uno superiore e uno inferiore.

le due strisce laterali di sinistra, quella superioe e qualla inferiore sono costituite da campioni standard di Mw note. Facendo quindi un confronto con queste bande, si può risalire al peso molecolare dei nostri campioni. Per una determinazione più precisa è possibile ricorrere alla seguente formula:

Rf= (Distanza migrazione del campione)/(distanza migrazione del colorante)

l’Rf è la mobilità elettroforetica; la distanza di migrazione del campione è la distanza percorsa dalla banda specifica dal pozzetto. Mentre la distanza del colorante è la distanza percorsa dal fronte del colorante. C’è una correlazione lineare tra l’Rf e il LogMw; si costruisce quindi una retta di taratura tra l’Rf e il LogMW dei campioni noti. Calcolando poi l’Rf dei nostri campioni da determinare, è facile risalire (grazie all’equazione della retta trovata) alla massa molecolare.

Ora vediamo un po’ di applicazioni pratiche: immaginamo di aver appena eseguito una PCR (per vedere cos’è in brevis una PCR potetevi leggervi un mio vecchio Post), e di voler vedere se abbiamo amplificato il frammento di DNA corretto, e se ci sono rumori di fondo (ovvero frammenti di DNA che si sono amplificati pur non essendo specifici ai primer). Io so (o in teoria dovrei sapere) le dimensioni  e la massa del mio frammento di DNA amplificato, e posso pertanto prelevare un’aliquota del mio campione, fare una corsa elettroforetica su un gel e vedere se si evidenzia  su questo gel una banda corrispondente al peso molecolare noto. Se la banda è nitida avremo avuto una amplificazione specifica, se invece vedremo sbavature, avremo ottenuto un’amplificazione indesiderata. Questo potrebbe farci indurre a ripetere l’esperimento.
L’elettroforesi è anche usata per la determinazione delle proteine presenti nel plasma (anzi, per meglio dire, nel siero) come ad esempio le immunoglobuline, le albumine, ecc…
Alcune tecniche di sequenziamento del DNA si basano sull’unione della PCR con l’elettroforesi. Insomma, l’elettroforesi è uno strumento estremamente utile e anche piuttosto semplice che è oramai insostituibile.

vi do un link molto molto bello, con molte immagini che vi illustreranno meglio il concetto:

Scienze a scuola

Per ultima cosa, è mio dovere aggiungere che esistono ovviamente diversi altri tipi di elettroforesi, come L’elettroforesi bidimensionale, e l’elttroforesi in campo pulsato, e che questo che ho appena spiegato è quello di base.

Come sempre, se avete dubbi, curiosità, domande, obiezioni, io sono qui. Ciau!

Tags: Biochimica, Biologia molecolare

This entry was posted on domenica, maggio 17th, 2009 at 14:59 and is filed under lente di barlow. You can follow any responses to this entry through the RSS 2.0 feed. You can leave a response, or trackback from your own site.