Cloning a gene….

Ok, rieccomi! So che aspettavate da tanto il mio ritorno. (certo certo, come no..). Allora, questo Post è dedicato ad un aspetto molto interessante della biologia molecolare di base, il clonaggio. Un clone è, come sapete, un organismo esattamente uguale ad un altro dal punto di vista genetico. Ora, per clonaggio io non intendevo quello che è stato fatto con la pecora Dolly (vi ricordate?), ma mi riferivo al clonaggio di singoli geni. Perché spesso per i ricercatori è molto utile avere grandi quantità di singoli geni, perché in questo modo è possibile sequenziarli o utilizzarli come sonde per studiarne l’espressione in tessuti o organismi. Oppure, per inciso, è anche possibile spezzettare il genoma di un organismo, clonare i singoli frammenti, e ottenere così le cosiddette librerie (library) nelle quali vengono conservati questi frammenti di DNA e utilizzati quando occorre; esistono diverse tipi di library, ma non è questo l’argomento del post.
Vi dicevo, appunto, clonaggio di geni. Per clonare un gene, ma è anche possibile clonare diversi geni contemporaneamente, possiamo sfruttare la potenza e l’efficienza di uno strumento di cui la natura già dispone, ovvero l’alta capacità replicativa dei microorganismi. Se noi, quindi, riusciamo ad inserire il gene di nostro interesse in un batterio od in un lievito e lo lasciamo replicare, otterremo molte copie del gene di partenza. Il problema è: come introduciamo questo gene? Alcuni microrganismi hanno la capacità di assumere DNA dall’ambiente esterno, ma è un processo raro e poco efficiente, senza contare che, se non si inserisce nel cromosoma batterico, non verrà tramandato alla progenie, rendendo il clonaggio impossibile. Vengono così utilizzati dei vettori (sempre delle molecole di DNA) in cui inizialmente si inserisce il gene di interesse, e secondariamente si fa in modo che questo vettore venga assunto dal microorganismo. Cosa cambia, direte voi, inserire il gene singolarmente dall’inserirlo come parte di una molecola di DNA più grande? Cambia eccome, e ora vediamo il perché.

Esistono diversi tipi di vettori, qui ci concentreremo sui più utilizzati, ovvero i plasmidi. Un plasmide è una molecola di DNA circolare extracromosomiale naturalmente presente all’interno di alcuni batteri. Può avere dimensioni variabili e solitamente non è indispensabile al batterio, ma è in grado comunque di dare alcune capacità aggiuntive come ad esempio la resistenza ad alcuni antibiotici, la capacità di metabolizzare substrati particolari ecc. Viene replicato ad ogni divisione cellulare grazie alla presenza di una sequenza, detta origine di replicazione, riconosciuta dalle DNA polimerasi batteriche. In questo modo il batterio si assicura che la sua progenie avrà lo stesso plasmide. Capite, vero, il significato evolutivo di questo processo?

I ricercatori sfruttano questo potente mezzo per clonare i geni di interesse. I plasmidi utilizzati di solito sono sintetici e hanno una struttura simile:

Come vedete, è una molecola circolare. Ma ha anche molte altre caratteristiche, fin più interessanti. Innanzitutto, come ogni buon plasmide che si rispetti, ha un’origine di replicazione, indicata come ori. Le frecce indicano la direzione del plasmide, ovviamente quella canonica 5’-3. La freccia nera è il sito multiplo di clonaggio (MCS) o polylinker. È una sequenza piena di siti di restrizione noti, ovvero siti in cui gli enzimi di restrizione tagliano specificamente il DNA. Questo è di cruciale importanza. Se noi vogliamo inserire un gene in questo plasmide, dobbiamo procedere al taglio dello stesso. Ma non un taglio a caso, assolutamente no! Deve essere un taglio specifico (uno e uno solo, altrimenti il plasmide non potrà più ricomporsi circolarmente). Inoltre le due estremità del plasmide libere, derivanti da questo taglio, non dovranno essere nette, come se fossero state tagliate da un paio di forbici (in gergo le estremità di questo tipo vengono chiamate Blunt, da non confondere col cantante!), ma sfalsate; per sfalsate significa che uno dei due filamenti del DNA sporge rispetto all’altro (è chiaro che se un estremità ha il filamento 5’-3’ sporgente, l’altra estremità avrà sporgente il filamento opposto), in modo che queste estremità possano riappaiarsi molto facilmente, vengono dette infatti sticky ends, ovvero appiccicose. Come mostrato in figura:

Ebbene Questo taglio ci serve per poter inserire nel plasmide il nostro gene di interesse. Quest’ultimo, a sua volta, dovrà avere le estremità adatte per poter legarsi al plasmide. Per ottenere questo si legano alle estremità del gene degli oligonucleotidi e li si taglia con lo stesso enzima di restrizione che si usa nel plasmide, in questo modo le estremità appiccicose sono complementari, e si potrà avere l’inserimento del gene nel plasmide. l’enzima di restrizione non deve però tagliare il gene in altri punti, ma solo alle estremità, per questo si deve fare molta attenzione agli enzimi di restrizione da usare (esistono dei programmi che individuano tutti i siti di restrizione presenti in una data sequenza, è meglio usarli per sapere se ci sono enzimi di restrizione che tagliano nel MCS ma non nel gene). Per far legare il gene con il plasmide, si utilizza un enzima chiamato Ligasi; la reazione si chiama di Ligazione.In teoria, voi direte, è finito qua; nel senso, noi inseriamo il gene nel plasmide, e non paghi di ciò inseriamo il plasmide ricombinante nei batteri(questo processo è chiamato trasformazione). Mettiamo i batteri a crescere, felici e contenti, su un terreno solido e otteniamo tantissime copie del nostro plasmide, e quindi del nostro gene. Già, peccato che c’è un piccolissimo ed insignificante dettaglio. Se facessimo solo così noi non avremmo la possibilità di distinguere i batteri che hanno assunto il plasmide da quelli che non l’hanno assunto (la trasformazione è un processo a resa piuttosto bassa), e per di più non riusciremmo a distinguere i batteri che hanno assunto il plasmide ricombinante da quelli che hanno assunto il plasmide senza il nostro gene (anche la ligazione non ha una resa del 100%, e alcuni plasmidi possono richiudersi su se stessi senza incorporare il gene). Come fare? Be, i ricercatori hanno risolto il problema molto elegantemente. Una delle cose più ammirevoli nella scienza è come gli scienziati riescano a trovare degli escamotage eleganti e raffinati per aggirare i problemi. Torniamo per un attimo a visionare la mappa del plasmide; vedete la frecciona indicata con ampicillin (Ampicillina in italiano)? L’Ampicillina è un antibiotico, quindi letale per i batteri; Bene, questo indica che nel plasmide è presente un gene (ampicillin, appunto) in grado di dare resistenza al batterio nei confronti di questo antibiotico. Questo gene viene detto marcatore di selezione, perché ci permette di distinguere i batteri che hanno assunto il plasmide, da quelli che non l’hanno fatto, perché i primi cresceranno anche i presenza dell’antibiotico, mentre i secondi no. Ok, benissimo, ma non basta; non possiamo ancora distinguere i batteri con il plasmide ricombinante da quelli con il plasmide originale (senza il gene). Qui il discorso si fa complesso, ma estremamente interessante. Ritorniamo a vedere la mappa del plasmide. Nel sito multiplo di clonaggio è indicato LacZ. Questo LacZ è un gene (uno dei responsabili della metabolizzazione del lattosio nei batteri) che codifica per un enzima, la B-galattosidasi. Se il plasmide ha ricombinato con il gene, quest’ultimo si è andato ad inserire nel bel mezzo del gene LacZ, inattivandolo (perché il gene, ricordiamolo, si inserisce all’interno del sito multiplo di clonaggio) Come facciamo però a verificare se questo è avvenuto o meno? Semplice, nel terreno di coltura dove i batteri vengono fatti crescere, oltre all’Ampicillina (in questo caso, ma esistono anche altri antibiotici verso i quali si può indurre una resistenza) aggiungiamo non il lattosio, bensì l’X-Gal. Questa molecola viene riconosciuta dalla B-galattosidasi e metabolizzata. Quando viene metabolizzato, l’X-Gal rilascia un gruppo cromogeno in grado di dare una colorazione blu. Quindi, ricapitoliamo: se il batterio cresce in presenza di antibiotico, vuol dire che ha assunto il plasmide. Se la colonia risultante sarà di colore Blu, vuol dire che il gene LacZ funziona ancora e che quindi il gene di interesse non è stato incorporato nel plasmide. Se invece cresce una colonia bianca, vuol dire che LacZ è stato inattivato dal gene di nostro interesse. Questo metodo viene detto selezione blu/bianco. Per essere precisi, oltre all’X-gal è necessario aggiungere ai batteri anche un’altra molecola, chiamata IPTG, in grado di favorire l’espressione del gene LacZ. Quindi, quando, dopo l’incubazione dei batteri (dopo la trasformazione), tiriamo fuori le piastre e diamo un’occhiata, potremo farci un’idea delle colonie ricombinanti da quelle non ricombinanti in base al loro colore, ricordo infatti che una colonia deriva da una singola cellula progenitrice, quindi siamo sicuri che tutte le cellule di una colonia sono uguali tra di loro.Questo è uno dei tanti metodi possibili. Probabilmente è il più famoso, o, se non lo fosse, è se non altro quello che ho usato in laboratorio, quindi quello che vi so spiegare con più sicurezza.Come dicevo, i plasmidi non sono gli unici vettori disponibili. Sono i più facili e più economici da usare, ma hanno lo “svantaggio” di avere una piccola capacità, nel senso che non sono stabili con inserti troppo grossi. Quindi, in caso volessimo clonare il genoma di un animale o di una pianta, risulterebbero un po’ scomodi. Ci sono altri vettori, più adatti a questo genere di esperimenti: i cosmidi, gli YAC e i BAC. Degni di nota sono anche i fagi, ovvero dei virus che possono essere usati come vettori. Forse mi occuperò di loro in prossimi post, oppure c’è sempre la mitica Wikipedia, anche se consiglio quella inglese.
Per curiosità, il laboratorio che ho fatto, prevedeva il clonaggio di un gene: l’angiopietina2 umana. Questo gene codifica per una proteina omonima che è stata associata (e da qui il nome) alla formazione di nuovi vasi sanguigni, pertanto estremamente importante nello sviluppo di alcuni tumori. Abbiamo usato come un ceppo di Escherichia coli come batteri. La mappa del plasmide utilizzato è quella che ho postato.

Come sempre, se avete domande, precisazioni, correzioni da fare, io sono qui! Ciaoooo!