Biologi al lavoro: La PCR

PCR è un acronimo che sta per Polymerase Chain Reaction, che per un italiano suonerebbe come reazione a catena della polimerasi. Ideata nel 1983 da un tale chiamato Kary Mullis. Questa scoperta che gli valse il premio Nobel nel 1993 è diventata oramai una tecnica fondamentale sia nella ricerca che nella diagnostica molecolare. Un biologo non può non saper fare una PCR.
Quello che una reazione di PCR fa è amplificare esponenzialmente una sequenza specifica di DNA o RNA. Ciò che dobbiamo capire è primo, come fa ad amplificare una sequenza specifica di DNA o RNA, e secondo, a cosa serve amplificare. Ma con calma, ogni cosa a suo tempo.
Innanzitutto occorrono alcune informazioni preliminari sulla struttura del DNA. La struttura del DNA (scoperta da Watson e Crick, i quali a loro volta si sono basati su degli esperimenti fatti da Rosalind Franklin) è a doppio filamento (double strand), i quali si avvolgono appaiandosi in una doppia elica destrorsa. Il DNA è un polimero, ovvero una macromolecola ottenuta legando assieme unità fondamentali, detti monomeri. Tutte le macromolecole biologiche sono polimeri (Acidi Nucleici, Carboidrati, Proteine) tranne i Lipidi. I monomeri del DNA, le sue unità fondamentali, sono i Nucleotidi; un Nucleotide è costituito da uno zucchero a 5 atomi di carbonio (un pentoso) in conformazione ciclica in cui il primo carbonio 1 si lega con il carbonio 4, formando quindi un anello carbonioso. Lo zucchero in questione è il desossiribosio. Al carbonio 1 dello zucchero (chiamato 1′, si legge uno primo) si lega una base azotata (A, T, C, G) che costituisce la sola parte variabile del nucleotide, al carbonio 5′ (cinque primo) si lega un gruppo fosfato (che conferisce tra l’altro l’acidità al DNA). Una cosa importante da sapere è che se il carbonio 1′ si lega alla base e quello 5′ al gruppo fosfato, i rimanenti carbonio 2′ e carbonio 3′ sono liberi (il 4, come ho detto, è impegnato con il 1 nel formare lo zucchero ciclico). Mentre il carbonio 2′ ha due atomi di idrogeno, il carbonio 3′ ha un atomo di idrogeno legato, assieme ad un gruppo ossidrile Alcolico (-OH). Questo gruppo OH al 3′ sarà molto importante.
In realtà il nucleotide così come l’abbiamo visto esiste solo quando fa già parte della catena di DNA. Quando è libero e deve essere aggiunto, è sottoforma di Nucleoside trifosfato: Il nucleoside (attenzione alla S al posto della T) è lo zucchero più la base al 1′. Un nucleoside trifosfato è un nucleoside a cui si aggiungono tre gruppi fosforici al carbonio 5′ (se finora avete seguito, capirete da soli che un nucleoTide non è altro che un nucleoSide monofosfato). Il nucleoside trifosfato, per essere aggiunto alla catena viene “preso” dall’enzima apposito, DNA polimerasi, il quale utilizza l’energia contenuta nei legami tra i tre gruppi fosforici, e in seguito alla scissione di questi legami, unisce il nucleoside ormai monofosfato con l’OH (ossidrile) libero del carbonio 3′ dello zucchero. Quindi ricaviamo una proprietà fondamentale. un filamento di DNA si assembla montando i monomeri uno dietro l’altro facendo reagire il fosfato al 5′ del nucleotide da aggiungere, al OH al 3′ del nucleotide precedente. In gergo si dice che il DNA si sintetizza in direzione 5′->3′ e non altrimenti. Si deduce anche che Un filamento di N nucleotidi ha due estremità diverse, un’estremità 5′ con un gruppo tri-fosfato libero e l’estremità opposta con il 3′-OH libero. Quando un filamento si accoppia ad un altro filamento per specifico appaiamento di basi ( A con T e C con G) attraverso ponti idrogeno) Questo appaiamento dei due filamenti è Antiparallelo: all’estremità 5′ di un filamento corrisponde l’estremità 3′ del filamento complementare, viceversa per l’estremità 3′ del filamento corrisponde la 5′ dell’altro: per convenzione un filamento singolo si rappresenta con direzionalità 5′->3′.
Sapendo quindi che 1) il DNA è un polimero di nucleotidi 2) i nucleotidi si assemblano in direzione 5′->3′ grazie alla DNA polimerasi e 3) i due filamenti sono antiparalleli, possiamo andare a vedere cos’è la PCR.
La PCR si basa sull’amplificazione per duplicazione dei filamenti di DNA; la tecnica ovviamente si svolge in vitro, ovvero in provetta.
Un’altra cosa che dobbiamo sapere è che questa DNA polimerasi, per iniziare a sintetizzare una molecola di DNA, deve innanzitutto avere il filamento complementare da usare come stampo, e secondo non può iniziare la sintesi di nessun filamento senza un innesco, che in inglese viene chiamato Primer. Un primer è una corta sequenza di nucleotidi a partire dalla quale la DNApol inizia ad attaccare nucleotidi usando un filamento come stampo.
Per amplificare una data sequenza di DNA, quindi, bisogna innanzitutto disegnarsi, grazie ad appositi software due primers. Questi Primers sono appunto degli oligonucleotidi attorno alle 20 paia di basi; questi primers non dovranno essere delle sequenze casuali, ovviamente, ma dovranno essere specifici. Specifici a cosa? Specifici uno ad una regione al 5′ e l’altro a quella al 3′ della sequenza da amplificare.
Questi primer sono complementari alle estremità 3′ della regione del DNA di interesse. In modo che la DNA polimerasi possa usarli per iniziare ad amplificare la regione di DNA compresa tra queste due sequenze.

Il primo primer, chiamato Forward, dovrà essere tale e quale la regione 5′ del filamento superiore, in modo da appaiarsi alla regione 3′ del filamento inferiore. In questo modo, questo primer permetterà alla DNApol di sintetizzare il filamento superiore, usando come stampo il filamento inferiore. Il secondo primer, chiamato Reverse, dovrà permettere la sintesi del filamento inferiore usando come stampo il filamento superiore, e pertanto dovrà essere complementare alla regione 3′ del filamento superiore. Avremo quindi secondo questo schema:

Notare il primer forward che si lega alla regione 3′ del filamento inferiore e che permette la trascrizione del filamento superiore. e il primer Reverse che è esattamente l’opposto. In questo modo la DNA polimerasi riesce a copiare la sequenza originale e a duplicarla. La PCR è una tecnica che si compone di Cicli di amplificazione, e in ogni ciclo la quantità della sequenza approssimativamente raddoppia. Ogni ciclo di amplificazione è caratterizzato da delle specifiche temperature, che permettono la corretta esecuzione della reazione. Ogni ciclo è così composto (Rifatevi alla figura per capire):

Step 1:alla temperatura di circa 90-94 °C i due filamenti di separano per il calore (Temp di Melting)

Step 2: alla temperatura di 55-60°C I primers si appaiano ai filamenti principali (Temp di Annealing)

Step 3: alla temperarura di 70°C la DNA polimerasi estende i primers e sintetizza la sequenza! (Temp di Extension).

Ovviamente date le temperature elevate, una DNApol normale non funzionerebbe, pertanto si utilizzano delle DNApol ottenute da batteri che vivono ad esempio, in sorgenti termali, e che lavorano a T molto alte (>70 °C). Ad esempio la Taq polimersi è ottenuta dal Batterio Termale Thermus Aquaticus (da cui Taq).
Abbiamo quindi capito che per fare una PCR servono: DNA da amplificare, Primers FWD e REV, Taq Polimerasi, Nucleosidi Trifosfati, alcuni ioni come Mg per stabilizzare l’enzima e infine Acqua. Il tutto in una provetta, che verrà messa in un apposita macchina che alternerà le giuste temperature. Di solito i cicli di amplificazione variano da 30 a 40 e le Temperature e i tempi possono essere aggiustati. Ovviamente le concentrazioni di ciascun reagente non sono fisse, ma possono essere regolate a seconda dei casi. Ad esempio, se abbiamo una sequenza molto lunga da amplificare (> 2000 paia di basi) sarà necessario dare più tempo alla fase di extension, per permettere alla Taq polimerasi di completare la sequenza prima dell’inizio di un nuovo ciclo. Saremmo anche portati ad aumentare i Nucleosidi trifosfato, ma attenzione, oltre una certa concentrazione i nucleosidi trifosfato inibiscono la reazione perchè catturano (chelano) il Mg che serve alla Taq.
Cio che la PCR può fare l’abbiamo visto. Ora capiamo perchè vogliamo farlo. La PCR è una tecnica molto generica, e proprio per questo può essere applicata ad un’infinità di studi. Dagli studi clinici, dove si può utilizzare per scoprire se dei pazienti con un determinato profilo clinico abbiano una mutazione a livello di un particolare gene. Io amplifico la regione del gene (in genere un esone) in cui credo ci sia una mutazione, e successivamente vado a sequenziare il prodotto di PCR. In questo modo vedrò il genotipo dei pazienti. Alle indagini della polizia scientifica, in cui tracce di DNA vengono usate per inchiodare o no un sospettato. Dalle tracce del DNA io amplifico determinate regioni ipervariabili (che variano cioè da persona a persona) e le sequenzio e le vado a confrontare con quelle del sospettato. Se c’è corrispondenza totale allora siamo di fronte allo stesso individuo (Idem per il test di Paternità). Infine, per la ricerca, la PCR è una tecnica insostituibile (Così come molte altre). Se voglio vedere quanto è espresso un gene, vado ad amplificare e a quantificare il suo RNA messaggero. e di esempi ne potrei fare a milioni. C’è sempre il problema della specificità e della contaminazione. Bisogna fare attenzione perchè se i primers non hanno una specificità totale, possiamo amplificare anche prodotti aspecifici. Questo posso vederlo attraverso una Elettroforesi: se trovo una banda delle dimensioni dell’amplificato e solo quella, ho ottime probabilità di avere amplificato la cosa giusta. Se invece trovo bande insolite potrebbero essere aspecificità. E’ anche vero che non sempre io so che cosa aspettarmi, e quindi diventa più difficile capire cosa ho amplificato. Per quanto riguarda le contaminazioni, si usa sempre fare almeno un conrollo negativo (in cui metto tutto, tranne il DNA da amplificare) e vedo attraverso una elettroforesi che cosa mi viene. Se non ho contaminazioni, questo controllo mi deve venire vuoto, ovvero non deve vedere nessuna banda (è possile vedere una banda molto piccola attorno ai 30bp, ma questi sono soltanto i primers che si sono accoppiati, i cosiddetti primer dimer). Se mi viene una banda, questa è senz’altro una contaminazione. Questa contaminazione o è un DNA sconosciuto, oppure spesso, è una contaminazione da uno degli altri campioni che si allestiscono (sono i più vicini ed è più probabile che siano loro la fonte di contaminazione). Ovviamente se così fosse, dovrei avere una banda paragonabile a quelle ottenute in questi campioni (ovviamente io parlo di bande, ma mi riferisco ovviamente alle bande che ottengo facendo correre le reazioni di PCR in un gel per elettroforesi, e per capire andare sul link che ho messo prima).
La PcR è una tecnica che amplifica, avrete capito, in modo esponenziale una sequenza. Se parto da una sequenza di partenza, dopo un ciclo ne avrò due, dopo due cicli ne avrò quattro, (X^n dove X è il numero di sequenze iniziali e n è il numero di cicli). Bisogna dire che non è sempre così, ovvero, solo in una periodo la reazione ha questo andamento, e non è neppure detto che abbia un’efficienza del 100% (principalmente il maggiore ostacolo è la durata della Taq polimerasi, sebbene sia stata progettata per funzionare ad alte temperature, dopo un tot di cicli inizia a diminuire la sua funzionalità; inoltre la concentrazione dei reagenti diminuisce progressivamente). Quindi bisogna fare attenzione.
Con questo è tutto. Spero vi abbia interessato e vi sia stato utile! se avete dubbi, domande o se notate errori usate i commenti! Non esitate!